FYLOGENIA Sanna & Johanna
Wikicampus
| Versio 18. maaliskuuta 2010 kello 11.08 Irsalon (Keskustelu | muokkaukset) ← Edellinen muutos |
Versio 18. maaliskuuta 2010 kello 11.22 Irsalon (Keskustelu | muokkaukset) Seuraava muutos → |
||
| Rivi 38: | Rivi 38: | ||
| '''PCR-reaktio''' | '''PCR-reaktio''' | ||
| - | Näytteestä monistettiin noin 500 emäsparin mittainen 18S-DNA-jakso PCR-reaktiolla. Tätä varten valmistettiin tilavuudeltaan 50 mikrolitran reaktioseos. Kahdeksaa näytettä varten valmistettiin yhteinen premix 10* tilavuudella, jotta voitiin tehdä myös kontrollinäyte ja jättää pipetointivaraa. Premixiin laitettiin järjestyksessä 395 mikrolitraa ionisoitua vettä, 50 mikrolitraa 10*puskuria, 20 mikrolitraa deoksinukleotideja, joita seoksessa on yleensä yhtä paljon kaikkia, sekä 10 mikrolitraa sekä reverse- että forward -aluketta. Nämä sekoitettiin vorteksoimalla ja spinnattiin. Seokseen lisättiin 5 mikrolitraa DNA -polymeraasientsyymiä, joka sekoitettiin varovasti naputtelemalla jotta se pysyisi toimintakykyisenä. Seos spinnattiin. Premixiä pipetoitiin 49 mikrolitraa eppendorfputkeen ja lisättiin 1 mikrolitra näytettä templaattiDNA:ksi, kontrolliputkeen lisättiin vettä. Reaktioseos sekoitettiin varovasti naputtelemalla. DNA monistettiin PCR:llä taulukon 2 (PCR-reaktio.xls)mukaisesti (forward- ja reverse-alukkeiden sulamislämpötilat olivat 62 °C ja 70 °C, vastaavasti). | + | Näytteestä monistettiin noin 500 emäsparin mittainen 18S-DNA-jakso PCR-reaktiolla. Tätä varten valmistettiin tilavuudeltaan 50 mikrolitran reaktioseos. Kahdeksaa näytettä varten valmistettiin yhteinen premix 10* tilavuudella, jotta voitiin tehdä myös kontrollinäyte ja jättää pipetointivaraa. Premixiin laitettiin järjestyksessä 395 mikrolitraa ionisoitua vettä, 50 mikrolitraa 10*puskuria, 20 mikrolitraa deoksinukleotideja, joita seoksessa on yleensä yhtä paljon kaikkia, sekä 10 mikrolitraa sekä reverse- että forward -aluketta. Nämä sekoitettiin vorteksoimalla ja spinnattiin. Seokseen lisättiin 5 mikrolitraa DNA -polymeraasientsyymiä, joka sekoitettiin varovasti naputtelemalla jotta se pysyisi toimintakykyisenä. Seos spinnattiin. Premixiä pipetoitiin 49 mikrolitraa eppendorfputkeen ja lisättiin 1 mikrolitra näytettä templaatti-DNA:ksi, kontrolliputkeen lisättiin vettä. Reaktioseos sekoitettiin varovasti naputtelemalla. DNA monistettiin PCR:llä taulukon 2 (PCR-reaktio.xls)mukaisesti. Alukkeiden sulamislämpötilat laskettiin kaavalla Tm = 4 x (G+C)° + 2 x (A+T)°, mistä laskettiin annealing-lämpötilat kaavalla Tann = Tm - 5. Forward- ja reverse-alukkeiden annealing-lämpötiloiksi saatiin 57 °C ja 65 °C. |
| PCR-tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä 200 mikrolitraa PB-puskuria. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan ja DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa. | PCR-tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä 200 mikrolitraa PB-puskuria. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan ja DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa. | ||
| Rivi 50: | Rivi 50: | ||
| Sekvensointia varten näytteestä tehtiin sekvensointi-PCR-reaktio erikseen sekä forward- että reverse-alukkeelle. Sekvensointinäyte valmistettiin pipetoimalla 1.5 mikrolitra tilavuudeltaan olevan näytteen päälle 1 mikrolitra sekvensointialuketta, 3 mikrolitraa BigDye Terminator v3.1 -reaktioseosta, joka sisältää leimaamattomat ja fluoresenssileimatut nukleotidit, polymeraasientsyymin ja puskuria, sekä 4 mikrolitraa laimennospuskuria. Reaktio täytettiin 20 mikrolitran tilavuuteen steriilillä vedellä, jota tässä tapauksessa käytettiin 10.5 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin naputtelemalla. Näyte spinnattiin ja asetettiin PCR-koneeseen, joka oli ohjelmoitu edellä kuvatulla tavalla. | Sekvensointia varten näytteestä tehtiin sekvensointi-PCR-reaktio erikseen sekä forward- että reverse-alukkeelle. Sekvensointinäyte valmistettiin pipetoimalla 1.5 mikrolitra tilavuudeltaan olevan näytteen päälle 1 mikrolitra sekvensointialuketta, 3 mikrolitraa BigDye Terminator v3.1 -reaktioseosta, joka sisältää leimaamattomat ja fluoresenssileimatut nukleotidit, polymeraasientsyymin ja puskuria, sekä 4 mikrolitraa laimennospuskuria. Reaktio täytettiin 20 mikrolitran tilavuuteen steriilillä vedellä, jota tässä tapauksessa käytettiin 10.5 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin naputtelemalla. Näyte spinnattiin ja asetettiin PCR-koneeseen, joka oli ohjelmoitu edellä kuvatulla tavalla. | ||
| - | Sekvensointinäyte puhdistettiin keräämällä DNA pelletiksi. Saostusreaktiota varten valmistettiin seos, johon sekoitettiin 40 mikrolitraa NA-asetaattia, 1000 mikrolitraa etanolia ja 40 mikrolitraa 125 mM EDTA-liuosta (etyleenidiamiinitetraetikkahappo). Kunkin näytteen päälle pipetointiin seosta 54 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin kääntelemällä. Saostusseoksen annettiin vaikuttaa 20 minuuttia, jonka jälkeen DNA kerättiin pelletiksi putkeen sentrifugoimalla 13 000 rmp 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen saostusseos poistettiin putkesta imulla. Koska eppendorfputki on sentrifugissa hieman kallellaan, DNA saostui hieman sivuun putken pohjasta. Tästä syystä lius oli mahdollista poistaa koskematta DNA-pellettiä. Putken asento sentrifugissa määrää pelletin paikan, joten imettäessä saostusliuosta on tärkeää muistaa putken orientaatio sentrifugissa. Saostusliuos on poistettava putkessa välittömästi sentrifugoinnin jälkeen, jotta DNA ei liukene uudelleen. Tämän jälkeen DNA pestiin 70% alkoholilla, putki sentrifugoitiin ja alkoholi imettiin pois. Putki laitettiin vielä kansi avoimena lämpökaappiin, jotta kaikki alkoholi haihtuisi. Näytteet pakastettiin. | + | Sekvensointinäyte puhdistettiin keräämällä DNA pelletiksi. Saostusreaktiota varten valmistettiin seos, johon sekoitettiin 40 mikrolitraa NA-asetaattia, 1000 mikrolitraa etanolia ja 40 mikrolitraa 125 mM EDTA-liuosta. Kunkin näytteen päälle pipetointiin seosta 54 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin kääntelemällä. Saostusseoksen annettiin vaikuttaa 20 minuuttia, jonka jälkeen DNA kerättiin pelletiksi putkeen sentrifugoimalla 13 000 rmp 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen saostusseos poistettiin putkesta imulla. Tämän jälkeen DNA pestiin 70% alkoholilla, putki sentrifugoitiin ja alkoholi imettiin pois. Putki laitettiin vielä kansi avoimena lämpökaappiin, minkä jälkeen näytteet pakastettiin. |
| - | Sekvensointia varten näyte suspensoitiin 10 mikrolitraan formamidia, joka stabiloi DNA:ta. Tämän jälkeen näytteet pipetoitiin kuoppalevylle, joka ladattiin sekvensointilaitteeseen. Tämän jälkeen laite käynnistettiin. | + | Sekvensointia varten näyte suspensoitiin 10 mikrolitraan formamidia. Näytteet pipetoitiin kuoppalevylle, joka ladattiin sekvensointilaitteeseen, minkä jälkeen laite käynnistettiin. |
| - | Sekvensointi ABI 3130xl Genetic Analyzer-laitteen avulla perustuu elektroforeesiin. Laite imee näytteet kuoppalevyltä kapillaareihin, joissa elektroforeesi tapahtuu. Sekvensointi-PCRvaiheessa reaktioon lisättävät elongaation lopettavat nukleotiditrifosfaatit ovat fluoresenssileimattuja. Laite erottelee elektroforeesin avulla eri pituiset DNA-jaksot ja lukee kunkin jakson päättävän nukleotidin leiman. Koska eri nukleotidit on leimattu erilaisilla leimoilla, laite pystyy selvittämään DNA-sekvensin emäsjärjestyksen. Laite tallettaa sekvenssin tiedot tietokoneohjelmaan, josta ne voidaan viedä analysoitaviksi toisiin ohjelmiin. Tiedostoon tulostuu sekä sekvenssin emäsjärjestys että kromatogrammi, jonka perusteella emäsjärjestys on rakentunut. | + | Sekvensointi ABI 3130xl Genetic Analyzer-laitteen avulla perustuu elektroforeesiin. Laite erottelee elektroforeesin avulla eri pituiset DNA-jaksot ja lukee kunkin jakson päättävän nukleotidin leiman. Laite tallettaa sekvenssin tiedot tietokoneohjelmaan, josta ne voidaan viedä analysoitaviksi toisiin ohjelmiin. Tiedostoon tulostuu sekä sekvenssin emäsjärjestys että kromatogrammi, jonka perusteella emäsjärjestys on rakentunut. |
| '''Sekvenssien tarkastelu''' | '''Sekvenssien tarkastelu''' | ||
Versio 18. maaliskuuta 2010 kello 11.22
Sisällysluettelo |
Onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-hyönteislahkossa?
Johanna Lehto ja Sanna Pausio
Tiivistelmä
Tutkimme luteiden fylogeniaa, mutta emme saaneet sekvenssejä.
Johdanto
Hyönteislahko Heteroptera (erilaissiipiset) on monimuotoinen ryhmä, johon kuuluu herbivoreja, petoja ja parasiitteja. Lahkon edustajat käyttävät erityyppisiä elinympäristöjä akvaattisista terrestrisiin. Heteroptera-lahkoon kuuluu noin 40 000 lajia, joista noin 800 esiintyy Suomessa. Lahko on jaoteltu morfologisten ominaisuuksien perusteella seitsemään alalahkoon, joista viisi - Nepomorpha (esim. vesiskorpionit), Gerromorpha (esim. vesimittarit), Leptopodomorpha, Cimicomorpha (esim. lutikka) ja Pentatomomorpha (esim. marjalude) - esiintyy Suomessa.
Heteroptera-lahko muodostaa yhdessä Homoptera-lahkon (yhtäläissiipiset) kanssa ylälahkon Hemiptera (nivelkärsäiset), joka puolestaan kuuluu suurimpaan monofyleettiseen hyönteiskohorttiin, Paraneopteraan. Kohortin kaikilla jäsenillä on holokineettinen kromosomisto. Holokineettisestä kromosomista puuttuu sentromeeri, jolloin sukkularihmat kiinnittyvät meioosissa koko kromosomin pituudelle.
Osalla Heteroptera-lahkon jäsenistä esiintyy akiasmaattista meioosia. Siinä homologisten kromosomien välille ei synny crossing-overeita, minkä vuoksi kromosomien välillä ei tapahdu rekombinaatiota. Ominaisuus on eliökunnassa polyfyleettinen ja sitä esiintyy ainoastaan heterogameettisella sukupuolella, joka Heteroptera-lahkon jäsenillä on koiras. Heteroptera -lahkossa akiasmaattinen meioosi on löydetty alalahkoista Nepomorpha, Leptopodomorpha ja Cimicomorpha.
Heteroptera-lahkon fylogenia on kiistanalainen (artikkeli?), sillä monet karyosystemaattiset markkerit, kuten meioosityyppi sekä sukupuolikromosomit ja niiden käyttäytyminen, vaihtelevat lahkon sisällä. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää, onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-lahkossa.
Aineisto ja menetelmät
Materiaali
Heteroptera-lahkon sisäisten sukulaisuussuhteiden arvioimiseen käytettiin ribosomaalista RNA:ta koodaavan 18S-DNA:n sekvenssitietoa. Aineistomme käsitti alkoholiin säilöttyä hyönteismateriaalia kuudentoista Cimicomorpha-, Gerromorpha-, Pentatomomorpha- ja Nepomorpha-alalahkoihin kuuluvan lajin osalta (taulukko 1???). Lisäaineistona käytettiin valmiita sekvenssejä 11 lajin osalta. Näistä yhdeksän Leptopodomorpha-, Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha-alalahkoihin kuuluvan lajin 18S-DNA oli sekvensoitu aiemmilla kursseilla (taulukko 1???). Lisäksi kahden lajin 18S-sekvenssitiedot haettiin NCBI:n GenBankista. Himacerus boops-lajin DNA-jakso oli sekvensoitu aiemmin museonäytteestä. Ulkoryhmäksi valittiin Homoptera-lahkoon kuuluva Hemiowoodwardia wilsoni.
DNA eristettiin hyönteismateriaalista Qiagen DNeasy Tissue Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti, minkä jälkeen näytteiden DNA-konsentraatio määritettiin spektrofotometrillä (Pharmacia BioTech, GeneQuant). 18S rDNA-geenialue monistettiin PCR-reaktiolla. PCR-tuotteet puhdistettiin QIAquick PCR Purification Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti. Näytteet sekvensoitiin ABI 3130XL-laitteella.
DNA:n eristys
Eristys aloitettiin jauhamalla n. 50 mg nestetypessä jäädytettyä hyönteismateriaalia hienoksi. Näytteeseen lisättiin ATL -puskuria ja sekä proteinaasi K:ta. Näyte sekoitettiin vorteksoimalla ja sitä inkuboitiin 55 C parin tunnin ajan, minkä jälkeen näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Näytteeseen lisättiin AL-puskuria, näyte sekoitettiin ja inkuboitiin 10 min. Näytteeseen lisättiin etanolia ja näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Seos pipetoitiin DNeasy -minipylvääseen, jonka membraanille DNA tarttui. Muut aineet poistettiin pylväästä sentrifugoimalla. Minipylväs asetettiin uuteen putkeen ja siihen kiinni jäänyt DNA pestiin lisäämällä pylvääseen AW1 -puskuria ja sentrifugoimalla, minkä jälkeen pesu toistettiin käyttäen AW2 -puskuria. DNA:ta sisältävä pylväs asetettiin eppendorfputkeen ja DNA irrotettiin siitä ddH2O:lla. Eluointitilavuus riippui näytteen sisältämästä DNA:n määrästä ja vaihteli 25 mikrolitrasta 100 mikrolitraan. Vesi pipetoitiin suoraan membraanille, inkuboitiin huoneenlämmössä 1 min ja näyte sentrifugoitiin, minkä jälkeen eluointi toistettiin.
DNA:n konsentraation määrittäminen
Puhdistetusta näytteestä määritettiin DNA -pitoisuus spektofotometrillä käyttäen aallonpituuden 260 nm absorbanssia.
Absorbanssin mittaamista varten näytteestä tehtiin 1:10 laimennos eluaationesteeseen. Tätä varten eppendorfputkeen pipetoitiin 10 mikrolitraa DNA:ta ja 90 mikrolitraa ddH2O:, jotka sekoitettiin vorteksoimalla. Spektrofotometri kalibroitiin ddH2O:lla. Tämän jälkeen näytelaimennokset pipetoitiin vuorotellen laitteen kyvettiin. Ollakseen luotettava absorbanssilukeman pitäisi osua välille 0.15 - 1.00. Absorbanssin lisäksi laite ilmoittaa myös näytteen ratio?, puhtauden prosentteina ja proteiinikonsentraation. Absorbanssin ja laimennoskertoimen avulla voidaan laskea näytteen konsentraatio, kaavalla A260*laimennoskerroin*50mikrogrammaa/ml (tulokset taulukossa).
PCR-reaktio
Näytteestä monistettiin noin 500 emäsparin mittainen 18S-DNA-jakso PCR-reaktiolla. Tätä varten valmistettiin tilavuudeltaan 50 mikrolitran reaktioseos. Kahdeksaa näytettä varten valmistettiin yhteinen premix 10* tilavuudella, jotta voitiin tehdä myös kontrollinäyte ja jättää pipetointivaraa. Premixiin laitettiin järjestyksessä 395 mikrolitraa ionisoitua vettä, 50 mikrolitraa 10*puskuria, 20 mikrolitraa deoksinukleotideja, joita seoksessa on yleensä yhtä paljon kaikkia, sekä 10 mikrolitraa sekä reverse- että forward -aluketta. Nämä sekoitettiin vorteksoimalla ja spinnattiin. Seokseen lisättiin 5 mikrolitraa DNA -polymeraasientsyymiä, joka sekoitettiin varovasti naputtelemalla jotta se pysyisi toimintakykyisenä. Seos spinnattiin. Premixiä pipetoitiin 49 mikrolitraa eppendorfputkeen ja lisättiin 1 mikrolitra näytettä templaatti-DNA:ksi, kontrolliputkeen lisättiin vettä. Reaktioseos sekoitettiin varovasti naputtelemalla. DNA monistettiin PCR:llä taulukon 2 (PCR-reaktio.xls)mukaisesti. Alukkeiden sulamislämpötilat laskettiin kaavalla Tm = 4 x (G+C)° + 2 x (A+T)°, mistä laskettiin annealing-lämpötilat kaavalla Tann = Tm - 5. Forward- ja reverse-alukkeiden annealing-lämpötiloiksi saatiin 57 °C ja 65 °C.
PCR-tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä 200 mikrolitraa PB-puskuria. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan ja DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa.
DNA:n määrittäminen PCR-tuotteesta
PCR-reaktion onnistuminen varmistettiin ajamalla reaktiotuote 0.8% agaroosigeelillä. Geeli valmistettiin liuottamalla 250 ml 1*TBE-puskuria 2.0 g agaroosia kuumentamalla mikroaaltouunissa kunnes seos kirkastui. Seos jäähdytettiin koko ajan sekoittaen n. 60 C ja siihen lisättiin 0.005% etydiumbromidia 12.5 mikrolitraa. Etydiumbromidi sitoutuu DNA:han ja värjää sen näkyväksi UV-valossa. Geeli kaadettiin tarjottimelle ja siihen asetettiin kaksi kampaa, niin että kaivoja tuli kahteen riviin. Ajonäytteet valmistettiin pipetoimalla PCR-reaktioista eppendorfputkeen 12 mikrolitraa PCR-tuotetta ja 2 mikrolitraa bromophenolblueta sisältävää latauspuskuria. Geeli peitettiin 1*TBE-puskurilla ja näytteet ladattiin kaivoihin. Kummallekin riville ladattiin myös molekyylipainomarkkeri, joka valmistettiin sekoittamalla 9 mikrolitraa TE-puskuria, 1 mikrolitraa markkeria ja 2 mikrolitraa latauspuskuria, sekä negatiivinen kontrolli, jossa oli 10 mikrolitraa TE-puskuria ? ja 2 mikrolitraa latauspuskuria. Geeliä ajettiin 120 V jännitteellä yli tunnin ajan.
Sekvensointi
Sekvensointia varten näytteestä tehtiin sekvensointi-PCR-reaktio erikseen sekä forward- että reverse-alukkeelle. Sekvensointinäyte valmistettiin pipetoimalla 1.5 mikrolitra tilavuudeltaan olevan näytteen päälle 1 mikrolitra sekvensointialuketta, 3 mikrolitraa BigDye Terminator v3.1 -reaktioseosta, joka sisältää leimaamattomat ja fluoresenssileimatut nukleotidit, polymeraasientsyymin ja puskuria, sekä 4 mikrolitraa laimennospuskuria. Reaktio täytettiin 20 mikrolitran tilavuuteen steriilillä vedellä, jota tässä tapauksessa käytettiin 10.5 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin naputtelemalla. Näyte spinnattiin ja asetettiin PCR-koneeseen, joka oli ohjelmoitu edellä kuvatulla tavalla.
Sekvensointinäyte puhdistettiin keräämällä DNA pelletiksi. Saostusreaktiota varten valmistettiin seos, johon sekoitettiin 40 mikrolitraa NA-asetaattia, 1000 mikrolitraa etanolia ja 40 mikrolitraa 125 mM EDTA-liuosta. Kunkin näytteen päälle pipetointiin seosta 54 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin kääntelemällä. Saostusseoksen annettiin vaikuttaa 20 minuuttia, jonka jälkeen DNA kerättiin pelletiksi putkeen sentrifugoimalla 13 000 rmp 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen saostusseos poistettiin putkesta imulla. Tämän jälkeen DNA pestiin 70% alkoholilla, putki sentrifugoitiin ja alkoholi imettiin pois. Putki laitettiin vielä kansi avoimena lämpökaappiin, minkä jälkeen näytteet pakastettiin.
Sekvensointia varten näyte suspensoitiin 10 mikrolitraan formamidia. Näytteet pipetoitiin kuoppalevylle, joka ladattiin sekvensointilaitteeseen, minkä jälkeen laite käynnistettiin.
Sekvensointi ABI 3130xl Genetic Analyzer-laitteen avulla perustuu elektroforeesiin. Laite erottelee elektroforeesin avulla eri pituiset DNA-jaksot ja lukee kunkin jakson päättävän nukleotidin leiman. Laite tallettaa sekvenssin tiedot tietokoneohjelmaan, josta ne voidaan viedä analysoitaviksi toisiin ohjelmiin. Tiedostoon tulostuu sekä sekvenssin emäsjärjestys että kromatogrammi, jonka perusteella emäsjärjestys on rakentunut.
Sekvenssien tarkastelu
Sekvenssit tuotiin BioEdit-ohjelmaan. Ohjelmalla on voidaan tarkastella sekvenssien emäsjärjestystä ja tarvittaessa korjata sitä kromatogrammin ja vastinjuosteen tietojen perusteella. Aluksi haluttu sekvenssi tuotiin ohjelmaan File - open-komennon avulla. Sekvenssin sai editointitilaan joko valikosta tai kaksoisnäpäyttämällä sevenssin nimeä. Uusia sekvenssejä projektiin voi lisätä file - import - sequence aligment file -komennon avulla. Ohjelmaan tuotiin saman näytteen forward- ja reverse-alukkeilla monistetut sekvenssit, jotka kohdennettiin. Aluksi määritettiin reverse-alukkeella monistettu juoste valitsemalla se ja valitsemalla valikosta sequence - nucleic acid - reverse complement. Komento kääntää reverse-juosteen vastaamaan forward-juosteen emäsjärjestystä. Myös kromatogrammi käännettiin valitsemalla view - reverse complement. Tämän jälkeen valittiin sequence - pairwise aligment -align two sequences (allow ends to slide), joka kohdensi sekvenssit. Uusi tiedosto tallennettiin, jonka jälkeen sitä voitiin editoida. Sekvensseistä etsittiin emäkset, joita sekvenssointiohjelma ei ollut pystynyt määrittämään fluoresenssileimojen perusteella. Mikäli toisesta nauhasta puuttui emäs, se pystyttiin lisäämään toisen juosteen tietojen perusteella. Mikäli molemmissa nauhoissa oli emäspuutos samassa kohtaa tai tiedot olivat keskenään ristiriitaiset, kromatogrammista tutkittiin, minkä emäksen emissiokäyrä missäkin kohdassa oli korkein. Mikäli kromatogrammistakaan ei pystynyt määrittämään emästä, sen tieto jäi puuttumaan sekvenssistä. BioEdit -ohjelma kertoi emäksen paikan sekvenssissä, joten sen etsiminen kromatogrammista oli helppoa. Kummankin juosteen loppupäässä oli yleensä huonoa sekvenssiä, joka sisälsi runsaasti epävarmoja emäksiä ja pseudosekvenssiä. Tällaiset jaksot leikattiin pois valmiista sekvenssistä. Kun sekvenssit oli editoitu, niiden tiedot yhdistettiin yhdeksi sekvenssiksi luomalla niistä uusi tiedosto valitsemalla accessory application - cap contig assembly program - run application. Tästä tiedostosta poistettiin forward ja reverse sekvenssit ja nimettiin contig-sekvenssi näytteen nimellä. Kun kaikkista sekvensseistä oli tehty contig-tiedostot, ne tuotiin samaan tiedostoon ja kohdennettiin keskenään. Samaan tiedostoon haettiin myös muutamia Heteroptera-ryhmän lisäsekvenssejä geenipankista sekä Homoptera-ryhmään kuuluva ulkoryhmän edustaja. Lisäsekvenssien piti edustaa 18s rDNA-sekvenssijakson sisällä samaa emäsjaksoa kuin alkuperäistenkin sekvenssien, jotta niiden vertailu oli mahdollista. Emäsjaksot kopioitiin GenBankista muodosta fasta format, palattiin BioEdit -ohjelmaan ja liitettiin tiedostoon valitsemalla File - Import from clipboard. Kohdentaminen tapahtui tapahtui valitsemalla kohdennettavat sekvenssit ja valitsemalla valikosta Acessori application - clustlW multiple aligment - run clustalW. Uusi tiedosto tallennettiin. Kohdennus perustuu sekvenssin sisällä oleviin konservoituneisiin jaksoihin, jotka ovat samankaltaisia eri ryhmien välillä. Kohdennukset tarkistettiin, koska ohjelma ei aina osaa kohdentaa sekvenssejä oikein ja niitä editoitiin sen mukaan, millainen mutaatio edellytti vähiten muutoksia kaikkien sekvenssien tasolla kun emäkset asetettiin mahdollisimman hyvin kohdakkain. Kohdennukset leikattiin muutaman emäksen tarkkuudella saman pituisiksi. Kohdennetusta aineistosta luotiin input-tiedosto fylogeniapuiden rakentamista varten kopioimalla sekvenssit note pad-ohjelmaan.
Puiden luominen
Puut rakennettiin Phylip-ohjelmistolla. Ohjelmisto on komentopohjainen ja lukee note pad -ohjelman tekstitiedostoja. Ennen puunrakennusohjelmiin viemistä sekvenssitiedoston pääte poistettiin. Tämän jälkeen ohjelmat pystyivät avaamaan infile-tiedoston. Ohjelmissa määritettiin aineiston muodoksi sequential. Kaikissa puunrakennusohjelmissa määritettiin myös ulkoryhmä sekvenssin järjestysnumeron perusteella. Ulkoryhmän perusteella ohjelmat pystyivät määrittämään sekvenssien alkuperäiset ominaisuudet.
Neighbor joining-puuta varten aineistosta tehtiin etäisyysmatriisi dnadist.exe-ohjelmalla ja puu rakennettiin neighbor.exe-ohjelmalla. Neigbour joining -menetelmä perustuu parittaisten geneettisten etäisyyksien laskemiseen näytteiden välillä. Mikäli sekvenssit ovat täysin samanlaiset, etäisyys on nolla. Tätä varten aineistosta täytyy rakentaa etäisyysmatriisi. Matriisista yhdistetään ensin näytteet, joiden geneettinen etäisyys on pienin. Tämän jälkeen etsitään seuraavaksi lähimpänä toisistaan oleva pari, mukaan luettuna lähimmän parin keskiarvo. Näin jatketaan, kunnes kaikki sekvenssit on yhdistetty puuhun. Tuloksena on yksi puu.
Parsimonia-puu rakennettiin DNApars.exe-ohjelmalla. Parsimonia -menetelmä perustuu ominaisuusmatriisiin. DNA-sekvenssejä tutkittaessa jokainen emäs muodostaa yhden ominaisuuden. Menetelmässä tutkitaan vain informatiivisiä ominaisuuksia, eli ominaisuuksia jotka muuntelevat tutkittavien näytteiden välillä. Ominaisuuksien perusteella rakennetaan useita puita. Puista valitaan ne, joiden toteutumiseen on tarvittu vähäisin mahdollinen määrä muutoksia ominaisuuksissa. Tällainen puu on aina myös lyhin. Lyhimmän puun etsimiseen on mahdollista käyttää useita eri optimaalisuuskriteerejä. Sekvenssiaineiston kohdalla käytetään yleensä Fitchin kriteeriä, jossa yksi tapahtunut muutos lasketaan aina saman arvoiseksi ja ominaisuuksien takaisin muuntuminen on sallittua. Parsimonia-menetelmässä tuloksena saattaa olla useita yhtä lyhyitä puita.
Maximum likelihood-puu rakennettiin DNAml.exe-ohjelmalla. Menetelmä perustuu todennäköisyyteen tavata kerätty aineisto jonkin hypoteesin vallitessa. DNA -sekvenssien tapauksessa hypoteesin muodostavat yhdessä evoluutiomalli ja rakennettu puu. Maksimum likelihood -menetelmässä aineistosta luodaan ensin yksi puu jollain helpolla menetelmällä. Liikkeelle voidaan lähteä esim. parsimonia-menetelmällä koostetusta puusta, jota lähdetään optimoimaan. Koska aineiston lisäysjärjestys vaikuttaa menetelmän lopputulokseen, se arvotaan yleensä useita kertoja. (jumble)
Fylogeniapuiden luotettavuuden arvioimiseksi aineisto satunnaistettiin bootstrap-menetelmällä seqboot.exe-ohjelmalla. Bootstrap-menetelmässä aineistosta luodaan uusia toistoja leikkaamalla aineiston sarakkeet irti toisistaan ja järjestelemällä ne uudelleen satunnaiseen järjestykseen, jolloin samat ominaisuusyhdistelmät toistuvat uudelleen satunnaisessa järjestyksessä. Aineistosta luotiin tuhat uutta toistoa. Bootstrap-aineistosta rakennettiin Neighbor joining-, Parsimonia- ja Maximum likelihood-puut edellä kuvatulla menetelmällä. NJ ja parsimonia-menetelmässä puut luotiin tuhannesta toistosta, mutta Ml-menetelmässä sen hitauden vuoksi toistoja annettiin vain 100.
Saaduista puista rakennettiin consensus-puu consense.exe-ohjelmalla. Puut rakennettiin kullakin menetelmällä luoduille bootstrap-puille erikseen. Consensus-puun tarkoituksena oli koota bootstrap-puista yksi puu, joiden oksanhaarojen todennäköisyysarvot määräytyivät sen perusteella, miten monissa bootstrap-puissa oksat haarautuivat samalla tavalla.
Puiden tarkasteluun käytettiin TreeView-ohjelmaa.
Tulokset
Eri menetelmillä koostetut konsensuspuut erosivat jonkin verran sekä toisistaan että morfologisten ominaisuuksien perusteella koostetusta erilaissiipisten fylogeniasta. Homogeenisimmin eri puissa sijoittuivat Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha- alalahkojen lajit, joita aineistossa myös oli eniten. Kaikissa puissa alalahkon Cimicomorpha- jäsenet muodostivat oman ryhmänsä, lukuun ottamatta Himacerus boobsia, joka sijoittui kaikissa puissa samaan haaraan Pentatomomorpha- alalahkon edustajien kanssa, vaikka todellisuudessa kuuluukin Cimicomorpha- ryhmään. Parsimonia -menetelmällä koostetussa puussa myös Orius niger sijoittui erilleen Cimicomorpha- alalahkosta, samaan haaraan Nepomorpha- alalahkon edustajan kanssa.
