FYLOGENIA Sanna & Johanna
Wikicampus
| Versio 11. maaliskuuta 2010 kello 14.45 Irsalon (Keskustelu | muokkaukset) (→Aineisto ja menetelmät) ← Edellinen muutos |
Versio 11. maaliskuuta 2010 kello 15.02 Irsalon (Keskustelu | muokkaukset) (→Aineisto ja menetelmät) Seuraava muutos → |
||
| Rivi 33: | Rivi 33: | ||
| PCR-reaktiossa on periaatteessa kolme vaihetta. Ensimmäisessä, denaturaariovaiheessa, lämpötila nostetaan niin korkeaksi, että DNA denaturoituu ja sen juosteet irtoavat toisistaan. Tämä tapahtuu 95 C lämpötilassa. Toisessa vaiheessa lämpötila lasketaan niin alas, että alukkeet voivat sitoutua yksijuosteiseen DNA:han. Tämä annealing-lämpötila riippuu alukkeiden guaniini+sytosiini ja adeniini+tymiini-suhteista, koska ne sitoutuvat parhaiten eri lämpötiloissa. Eri alukkeille voidaan laskea emäspitoisuuksien perusteella sulamislämpötila Tm kaavalla 4*(G+C)+2*(A+T). Annealing -lämpötila on Tm-5. Reaktion annealing-lämpötila taulukossa. Koska DNA monistuu vain 5'3'suunnassa, PCR-reaktioissa käytetään kahta aluketta, forward ja reverse, jotka liittyvät DNA:n vastinjuosteisiin. Usein alukkeiden sulamislämpötilat eroavat toisistaan, jolloin reaktion annealing -lämpötila täytyy sovittaa niiden väliin, yleensä lähemmäs alempaa lämpötilaa, sillä liian korkea lämpötila saattaa estää alukkeen kiinnittymisen kokonaan. Toisaalta liian alhainen lämpötila tekee reaktiosta epäspesifin. Viimeinen vaihe on ekstensiovaihe, jossa reaktiossa olevat nukleotidit kiinnittyvät entsyymin avustuksella alukkeisiin templaattiDNA:n mallin mukaisesti. Ekstensiovaiheen lämpötila ja kesto riippuu käytetystä polymeraasientsyymistä sekä templaattiDNA:n pituudesta ja konsentraatiosta. PCR-reaktioissa yleisimmin käytetyllä entsyymillä, Taq-entsyymillä lämpötila on 72 C. Näitä vaiheita toistetaan reaktiossa yleensä 25-35 kertaa. Liian useat toistot altistavat epäspesifisten reaktiotuotteiden synnylle. Reaktion aluksi tehdään yleensä pitempi alkudenaturaatio, jonka tarkoituksena on varmistaa pitkien templaattiDNA juosteiden denaturoituminen. Reaktion lopuksi tehdään pitempi loppuekstensio, jonka tarkoitus on varmistaa viimeisten reaktioiden tapahtuminen loppuun asti. Reaktio voidaan lopettaa lisäämällä EDTA:a tai jäähdyttämällä näyte 4 C, jossa näytettä voidaan säilyttää jonkin aikaa. | PCR-reaktiossa on periaatteessa kolme vaihetta. Ensimmäisessä, denaturaariovaiheessa, lämpötila nostetaan niin korkeaksi, että DNA denaturoituu ja sen juosteet irtoavat toisistaan. Tämä tapahtuu 95 C lämpötilassa. Toisessa vaiheessa lämpötila lasketaan niin alas, että alukkeet voivat sitoutua yksijuosteiseen DNA:han. Tämä annealing-lämpötila riippuu alukkeiden guaniini+sytosiini ja adeniini+tymiini-suhteista, koska ne sitoutuvat parhaiten eri lämpötiloissa. Eri alukkeille voidaan laskea emäspitoisuuksien perusteella sulamislämpötila Tm kaavalla 4*(G+C)+2*(A+T). Annealing -lämpötila on Tm-5. Reaktion annealing-lämpötila taulukossa. Koska DNA monistuu vain 5'3'suunnassa, PCR-reaktioissa käytetään kahta aluketta, forward ja reverse, jotka liittyvät DNA:n vastinjuosteisiin. Usein alukkeiden sulamislämpötilat eroavat toisistaan, jolloin reaktion annealing -lämpötila täytyy sovittaa niiden väliin, yleensä lähemmäs alempaa lämpötilaa, sillä liian korkea lämpötila saattaa estää alukkeen kiinnittymisen kokonaan. Toisaalta liian alhainen lämpötila tekee reaktiosta epäspesifin. Viimeinen vaihe on ekstensiovaihe, jossa reaktiossa olevat nukleotidit kiinnittyvät entsyymin avustuksella alukkeisiin templaattiDNA:n mallin mukaisesti. Ekstensiovaiheen lämpötila ja kesto riippuu käytetystä polymeraasientsyymistä sekä templaattiDNA:n pituudesta ja konsentraatiosta. PCR-reaktioissa yleisimmin käytetyllä entsyymillä, Taq-entsyymillä lämpötila on 72 C. Näitä vaiheita toistetaan reaktiossa yleensä 25-35 kertaa. Liian useat toistot altistavat epäspesifisten reaktiotuotteiden synnylle. Reaktion aluksi tehdään yleensä pitempi alkudenaturaatio, jonka tarkoituksena on varmistaa pitkien templaattiDNA juosteiden denaturoituminen. Reaktion lopuksi tehdään pitempi loppuekstensio, jonka tarkoitus on varmistaa viimeisten reaktioiden tapahtuminen loppuun asti. Reaktio voidaan lopettaa lisäämällä EDTA:a tai jäähdyttämällä näyte 4 C, jossa näytettä voidaan säilyttää jonkin aikaa. | ||
| - | PCR-reaktio ei yleensä ole täydellinen, vaan reaktioon jää irrallisia nukleotideja ja DNA:ta. Tämän vuoksi PCR-tuote pitää yleensä puhdistaa ennen analysointia. Näyte voidaan puhdistaa kitin avulla tai alkoholilla. Kitin avulla puhdistaminen on nopeampaa, mutta kalliimpaa. Tässä työssä tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. | + | PCR-reaktio ei yleensä ole täydellinen, vaan reaktioon jää irrallisia nukleotideja ja DNA:ta. Tämän vuoksi PCR-tuote pitää yleensä puhdistaa ennen analysointia. Näyte voidaan puhdistaa kitin avulla tai alkoholilla. Kitin avulla puhdistaminen on nopeampaa, mutta kalliimpaa. Tässä työssä tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä PB-puskuria. Tässä työssä 200 mikrolitraa. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan kaiken etanolin poistamiseksi.DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa. |
| + | |||
| + | PCR-reaktion onnistuminen varmistettiin ajamalla reaktiotuote 0.8% agaroosigeelillä. | ||
Versio 11. maaliskuuta 2010 kello 15.02
Otsikko: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Tekijät: Johanna Lehto ja Sanna Pausio
Sisällysluettelo |
Tiivistelmä
Tutkimme luteiden fylogeniaa, mutta emme saaneet sekvenssejä.
Johdanto
Hyönteislahko Heteroptera (erilaissiipiset) on monimuotoinen ryhmä, joka yhdessä lahkon Homoptera (yhtäläissiipiset) kanssa muodostaa ylälahkon Hemiptera (nivelkärsäiset). Lahkon edustajat käyttävät erityyppisiä elinympäristöjä akvaattisista terrestrisiin. Ryhmään kuuluu herbivoreja, petoja ja parasiitteja. Erilaissiipisiin luokiteltavia lajeja on noin 40 000. Suomessa lajeja on n. 800. Lahko on jaoteltu morfologisten ominaisuuksien perusteella seitsemään alalahkoon (taulukko 1), joista viisi, Nepomorpha (esim. vesiskorpionit), Gerromorpha (esim. vesimittarit), Leptopodomorpha, Cimicomorpha (esim. lutikka)ja Pentatomomorpha (esim. marjalude) esiintyy Suomessa. Heteroptera -lahkon fylogenia on kiistanalainen. (artikkeli?)Lahkon sisällä monet karyosystemaattiset markkerit, kuten meioosityyppi, sukupuolikromosomit ja niiden käyttäytyminen, vaihtelevat. Hemiptera -ylälahko kuuluu osana suurimpaan monofyleettiseen hyönteiskohorttiin, Paraneopteraan. Kohortin kaikilla jäsenillä on holokineettinen kromosomisto. Holokineettisestä kromosomista puuttuu sentromeeri, jolloin sukkularihmat kiinnittyvät meioosissa koko kromosomin pituudelle. Lajeilla, joilla on holosentrinen kromosomisto voi esiintyä asiasmaattista meioosia, jossa homologisten kromosomien välille ei synny crossin-overeita eikä siis rekombinaatiota kromosomien välillä tapahdu. Ominaisuus on eliökunnassa polyfyleettinen ja esiintyy ainoastaan heterogameettisella sukupuolella, joka erilaissiipisillä on koiras. Heteroptera -lahkossa akiasmaattinen meioosi on löydetty alahkoista Nepomorpha,Leptopodomorpha ja Cimicomorpha. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää, onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera- hyönteiskohortissa.
Aineisto ja menetelmät
Materiaali
Aineistomme käsittää ribosomaalista RNA:ta koodavan 18S-DNA-sekvenssijakson tiedot kahdeksantoista(?)Heteroptera-lahkoon kuuluvan lajin osalta. Käytössämme oli hyönteismateriaalia Cimicomorpha-, Gerromorpha-, Pentatomomorpha- ja Nepomorpha-alalahkoista (taulukko 1). Himacerus boopsista oli käytettävissä museonäyte. Lisäksi Leptopodomorpha-, Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha-alalahkoista oli käytössä aiempaa 18S-sekvenssitietoa. Orius nigerin ja Hemiowoodwardia wilsonin (ulkoryhmä) 18S-sekvenssitiedot haettiin NCBI:n GenBankista.
DNA eristettiin hyönteismateriaalista Qiagen DNeasy Tissue Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti, minkä jälkeen näytteiden DNA-konsentraatio määritettiin spektrofotometrillä Pharmacia BioTech, GeneQuant. 18S rDNA-geenialue monistettiin PCR-reaktiolla. PCR-tuotteet puhdistettiin QIAquick PCR Purification Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti. Näytteet sekvensoitiin ABI 3130XL-laitteella.
Eristys aloitettiin jauhamalla n. 50 mg nestetypessä jäädytettyä näytettä hienoksi (mekaaninen vaihe). Näytteen määrä oli rajoitettu, koska DNeasy -keräyspylvään kyky kerätä DNA:ta on rajallinen. Näytteeseen lisättiin ATL -puskuria, joka toimi detergenttinä hajottaen solukalvot (kemiallinen vaihe), sekä proteinaasi K:ta proteiinien hajoittamiseksi ja DNA:n suojelemiseksi hydrolyysiltä (entsymaattinen vaihe). Näyte sekoitettiin vorteksoimalla, jotta vaikuttavat aineet pääsivät kosketuksiin kohdeyhdisteiden kanssa ja näytettä inkuboitiin 55 C parin tunnin ajan, jotta solukalvot ja proteiinit ehtivät hajota. Tämän jälkeen näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Näytteeseen lisättiin AL-puskuria (miksi?), näyte sekoitettiin ja inkuboitiin 10 min. Näytteeseen lisättiin etanolia, joka poistaa DNA- molekyylien pinnalta vesikerroksen ja paljastaa molekyylin negatiivisti varautuneet fosfaattiosat. Näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Seos pipetoitiin DNeasy -minipylvääseen, jonka membraanille DNA tarttui. Muut aineet poistettiin pylväästä sentrifugoimalla ja heitettiin pois keräysputken mukana. Minipylväs asetettiin uuteen putkeen ja siihen kiinni jäänyt DNA pestiin lisäämällä pylvääseen AW1 -puskuria ja sentrifugoimalla. Neste heitettiin putken mukana pois ja pesu toistettiin käyttäen AW2 -puskuria. DNA:ta sisältävä pylväs poistettiin varovasti, jotta mukaan ei tulisi etanolia ja keräysputki heitettiin menemään. Tämän jälkeen minipylväs asetettiin eppendorfputkeen ja DNA irrotettiin siitä ionisoidulla vedellä. Eluointitilavuus riippui näytteen sisältämästä DNA:n määrästä ja vaihteli 25 mikrolitrasta 100 mikrolitraan. Vesi pipetoitiin suoraan membraanille, inkuboitiin huoneenlämmössä 1 min ja näyte sentrifugoitiin. Eluointi toistettiin DNA:n saannin maksimoimiseksi. Vain yhteen kertaan eluoiminen olisi lisännyt DNA:n konsentraatiota, mutta vähentänyt totaaliDNA:n määrää. Puhdistetusta näytteestä määritettiin DNA -pitoisuus spektofotometrillä, jonka toiminta perustuu aineen kykyyn absorboida säteilyä, tavallisesti ultravioletti- tai näkyvää valoa. Mitä suurempi on aineen konsentraatio, sitä enemmän se absorboi säteilyä. Tässä työssä mitattiin ultraviolettivalon aallonpituuden 260 nm absorbanssia.
Absorbanssin mittaamista varten näytteestä tehtiin 1:10 laimennos eluaationesteeseen. Tätä varten eppendorfputkeen pipetoitiin 10 mikrolitraa DNA:ta ja 90 mikrolitraa ionisoitua vettä, jotka sekoitettiin vorteksoimalla. Spektrofotometri kalibroitiin ionisoidulla vedellä. Tämän jälkeen näytelaimennokset pipetoitiin vuorotellen laitteen kyvettiin varoen ilmakuplien syntymistä. Ollakseen luotettava absorbanssilukeman pitäisi osua välille 0.15 - 1.00.Absorbanssin lisäksi laite ilmoittaa myös näytteen ratio?, puhtauden prosentteina ja proteiinikonsentraation. Absorbanssin ja laimennoskertoimen avulla voidaan laskea näytteen konsentraatio, kaavalla A260*laimennoskerroin*50mikrogrammaa/ml. Tulokset taulukossa.
Näytteestä monistettiin noin 500 emäksen mittainen 18s rDNa jakso PCR -reaktiolla. Tätä varten valmistettiin tilavuudeltaan 50 mikrolitran reaktioseos. Kahdeksaa näytettä varten valmistettiin yhteinen premix 10* tilavuudella, jotta voitiin tehdä myös kontrollinäyte ja jättää pipetointivaraa. Premixiin laitettiin järjestyksessä 395 mikrolitraa ionisoitua vettä, 50 mikrolitraa 10*puskuria, 20 mikrolitraa deoksinukleotideja, joita seoksessa on yleensä yhtä paljon kaikkia, sekä 10 mikrolitraa sekä reverse- että forward -aluketta. Nämä sekoitettiin vorteksoimalla ja spinnattiin. Seokseen lisättiin 5 mikrolitraa DNA -polymeraasientsyymiä, joka sekoitettiin varovasti naputtelemalla jotta se pysyisi toimintakykyisenä. Seos spinnattiin. Premixiä pipetoitiin 49 mikrolitraa eppendorfputkeen ja lisättiin 1 mikrolitra näytettä templaattiDNA:ksi, kontrolliputkeen lisättiin vettä. Reaktio sekoitettiin varovasti naputtelemalla.
PCR-reaktiossa on periaatteessa kolme vaihetta. Ensimmäisessä, denaturaariovaiheessa, lämpötila nostetaan niin korkeaksi, että DNA denaturoituu ja sen juosteet irtoavat toisistaan. Tämä tapahtuu 95 C lämpötilassa. Toisessa vaiheessa lämpötila lasketaan niin alas, että alukkeet voivat sitoutua yksijuosteiseen DNA:han. Tämä annealing-lämpötila riippuu alukkeiden guaniini+sytosiini ja adeniini+tymiini-suhteista, koska ne sitoutuvat parhaiten eri lämpötiloissa. Eri alukkeille voidaan laskea emäspitoisuuksien perusteella sulamislämpötila Tm kaavalla 4*(G+C)+2*(A+T). Annealing -lämpötila on Tm-5. Reaktion annealing-lämpötila taulukossa. Koska DNA monistuu vain 5'3'suunnassa, PCR-reaktioissa käytetään kahta aluketta, forward ja reverse, jotka liittyvät DNA:n vastinjuosteisiin. Usein alukkeiden sulamislämpötilat eroavat toisistaan, jolloin reaktion annealing -lämpötila täytyy sovittaa niiden väliin, yleensä lähemmäs alempaa lämpötilaa, sillä liian korkea lämpötila saattaa estää alukkeen kiinnittymisen kokonaan. Toisaalta liian alhainen lämpötila tekee reaktiosta epäspesifin. Viimeinen vaihe on ekstensiovaihe, jossa reaktiossa olevat nukleotidit kiinnittyvät entsyymin avustuksella alukkeisiin templaattiDNA:n mallin mukaisesti. Ekstensiovaiheen lämpötila ja kesto riippuu käytetystä polymeraasientsyymistä sekä templaattiDNA:n pituudesta ja konsentraatiosta. PCR-reaktioissa yleisimmin käytetyllä entsyymillä, Taq-entsyymillä lämpötila on 72 C. Näitä vaiheita toistetaan reaktiossa yleensä 25-35 kertaa. Liian useat toistot altistavat epäspesifisten reaktiotuotteiden synnylle. Reaktion aluksi tehdään yleensä pitempi alkudenaturaatio, jonka tarkoituksena on varmistaa pitkien templaattiDNA juosteiden denaturoituminen. Reaktion lopuksi tehdään pitempi loppuekstensio, jonka tarkoitus on varmistaa viimeisten reaktioiden tapahtuminen loppuun asti. Reaktio voidaan lopettaa lisäämällä EDTA:a tai jäähdyttämällä näyte 4 C, jossa näytettä voidaan säilyttää jonkin aikaa.
PCR-reaktio ei yleensä ole täydellinen, vaan reaktioon jää irrallisia nukleotideja ja DNA:ta. Tämän vuoksi PCR-tuote pitää yleensä puhdistaa ennen analysointia. Näyte voidaan puhdistaa kitin avulla tai alkoholilla. Kitin avulla puhdistaminen on nopeampaa, mutta kalliimpaa. Tässä työssä tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä PB-puskuria. Tässä työssä 200 mikrolitraa. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan kaiken etanolin poistamiseksi.DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa.
PCR-reaktion onnistuminen varmistettiin ajamalla reaktiotuote 0.8% agaroosigeelillä.
Sekvenssit tuotiin BioEdit-ohjelmaan. Forward- ja reverse-alukkeilla sekvensoidut alueet kohdennettiin ja sekvenssiä editoitiin, minkä jälkeen kaikki sekvenssit kohdennettiin keskenään. Kohdennetusta aineistosta luotiin input-tiedosto fylogeniapuiden rakentamista varten.
Puut rakennettiin PHYLIP-ohjelmistolla. Neighbor joining-puuta varten aineistosta tehtiin etäisyysmatriisi dnadist.exe-ohjelmistolla ja puu rakennettiin neighbor.exe-ohjelmalla. Parsimonia-puu rakennettiin DNApars.exe-ohjelmalla. Maximum likelihood-puu rakennettiin DNAml.exe-ohjelmalla. Fylogeniapuiden luotettavuuden arvioimiseksi aineisto satunnaistettiin bootstrap-menetelmällä seqboot.exe-ohjelmalla ja bootstrap-aineistosta rakennettiin Neighbor joining-, Parsimonia- ja Maximum likelihood-puut edellä kuvatulla menetelmällä. Saaduista puista rakennettiin consensus-puu consense.exe-ohjelmalla. Puiden tarkasteluun käytettiin TreeView-ohjelmaa.
Tulokset
Eri menetelmillä koostetut konsensuspuut erosivat jonkin verran sekä toisistaan että hyväksytystä erilaissiipisten fylogenista. Homogeenisimmin eri puissa sijoittuivat Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha- alalahkojen lajit, joita aineistossa myös oli eniten. Kaikissa puissa alalahkon Cimicomorpha- jäsenet muodostivat oman ryhmänsä, lukuun ottamatta Himacerus boobsia, joka sijoittui kaikissa puissa samaan haaraan Pentatomomorpha- alalahkon edustajien kanssa, vaikka todellisuudessa kuuluukin Cimicomorpha- ryhmään. Parsimonia -menetelmällä koostetussa puussa myös Orius niger sijoittui erilleen Cimicomorpha- alalahkosta, samaan haaraan Nepomorpha- alalahkon edustajan kanssa.
