FYLOGENIA Terhi& Karin

Wikicampus

Otsikko: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Tekijät: Terhi Helenius ja Karin Sostar

Sisällysluettelo 1 Tiivistelmä 2 Johdanto 3 Aineisto ja menetelmät 4 Tulokset 5 Tarkastelu

Tiivistelmä

Kyllä tään pitäis toimia...Tutkimme...xxx

Johdanto

Akiasmaattisessa meioosissa homologisten kromosomien välille ei synny kiasmoja. Mikäli lajilla esiintyy akiasmaattista meioosia, se ilmenee vain heterogameettisella sukupuolella ja homogameettisen sukupuolen meioosi on normaali kiasmallinen meioosi. Akiasmaattisen meioosin omaavalla sukupuolella geenien kytkentä on absoluuttinen eikä rekombinaatiota tästä syystä tapahdu. Neighbour joining –menetelmällä kahden sekvenssin puutrakennetaan etäisyysmatriisien perusteella, jotka perustuvat nukleotidien eroihin sekvenssien välillä. Puut rakennetaan etenemällä pienimmän etäisyysmatriisin omaavista taksoneista vähitellen suurempiin. Etäisyydet eivät kuitenkaan kerro välttämättä tapahtuneiden muutosten määrää, sillä takaisinmutaatiot eivät näy etäisyysmatriisissa. Virhettä kertyy myös siitä mitä kauempana vertailtavat taksonit ovat toisistaan. Parsimonia menetelmä etsii puuta, joka selittää kohdennuksessa olevat erot vähimmillä muutoksilla. Menetelmässä virheitä kertyy siitä, ettei evoluutio aina nuodata vähäisimpiin muutoksiin perustuvaa mallia. Sekvenssien muutokset tapahtuvat myös eri tahtia. DNA-sekvenssin synonyymisia mutaatioita on paljon enemmän kuin synonyymisia, jolloin näitä painotetaan eri tavalla. Maximum likelihood –menetelmän ideana on, että menetelmällä tehty fylogenia-puu on evoluution kannalta todennäköisin. Ohjelma tarkastelee puuta tehdessään mm. mikä on todennäköisyys että emäs muuttuu toiseksi sekä mikä on transversioiden ja transitioiden suhde. Näiden perusteella saadaan johonkin evoluutiomalliin perustuva puu, joka on todennäköisin estimaatti .

Bootstrap-menetelmä on yksinkertainen, mutta tehokas menetelmä, jolla pystytään luomaan monia vaihoehtoisia versioita käytössä olevasta datasta. Bootstrapin avulla voidaan päästä luotettavampiin tilastollisiin tuloksiin. Bootstrap-menetelmällä uudet ”näytteet ”luodaan valitsemalla mittaustulos sattumanvaraisesti alkuperäisistä aineistosta sekä palauttamalla ne takaisin aineistoon ennen uuden näytteen sattumanvaraista valintaa

Työssä käytimme bootstrap-menetelmää luotettavampien fylogenia puiden rakentamiseen. Aineistosta valittiin sekvenssejä sattumanvaraisesti uusien ”näytteiden” muodostamiseksi. Näistä pseudoreplikaateista muodostui useita neighbour joining-, maximum likelihood ja parsimonia puita. Näistä monista puuvaihtoehdoista rakennettiin yksi konsesus-puu jokaiselle puutyypille(neighbour joining, maximum likelihood ja parsimonia).

Työn tarkoituksena on selvittää, 18S rDNA-aineistoa apuna käyttäen, onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera lahkossa. Tutkimme myös tukeeko DNA-analyysiin perustuva jaottelu morfologisin perustein esitettyä systemaattista luokittelua sekä niiden pohjalta esitettyjä fylogenioita.

Aineisto ja menetelmät

DNA:n eristäminen hyönteismateriaalista Qiagen Dneasy Tissue Kit:in avulla

Työ aloitettiin eristämällä DNA:ta alkoholiin säilötyistä hyönteisistä. 1,5 ml:n eppendorf-putki jäähdytettiin nestemäisessä typessä, jota myös otettiin putkeen. Hyönteiset jauhettiin nestemäisessä typessä mikrosurvimen avulla, minkä jälkeen putkeen lisättiin 180 μl:aa ATL-puskuria sekä 20 μl:aa proteinaasi K:ta, joka hajottaa seoksen proteiineja. Seokset vorteksoitiin ja niitä inkuboitiin 55°C:ssa vajaa 3 tuntia (2h 40min). Inkuboinnin aikana seoksia vorteksoitiin pari kertaa. Inkubaation jälkeen seoksia vorteksoitiin 15 s, minkä jälkeen lisättiin 200 μl:aa AL-puskuria, joka lopettaa proteinaasi K:n toiminnan. Näytteet sekoitettiin vorteksoimalla. Tämän jälkeen niiden annettiin inkuboitua 70°C:ssa 10 minuutin ajan. Eppendorf-putkiin lisättiin 200 μl:aa absoluuttista etanolia DNA:n saostamiseksi ja sekoitettiin hyvin vorteksoimalla. Seokset pipetoitiin keräysputkessa oleviin DNeasy –minipylväisiin ja sentrifugoitiin 8000 rpm (600 x g) minuutin ajan. Pylväiden läpi tulleet liuokset heitettiin pois ja pylväät asetettiin uuteen keräysputkeen. Dneasy-minipylväisiin pipetoitiin 500 μl:aa AW1-puskuria, minkä jälkeen näytteitä sentrifugoitiin uudelleen 8000 rpm (600 x g) minuutin ajan. Pylväiden läpi tulleet liuokset heitettiin taas pois ja pylväät asetettiin uusiin keräysputkiin. Pylväisiin lisättiin 500 μl:aa AW2-puskuria, minkä jälkeen suoritettiin 3 minuutin sentrifugointi täydellä teholla, jotta Dneasy-minipylväiden membraanit kuivuisivat. Pylväiden lävitse menneet nesteet heitettiin pois ja pylväät asetettiin puhtaisiin 1,5 ml:n eppendorf-putkiin. Eluointia varten pylväiden membraaneille pipetoitiin, näytteen koosta riippuen, 25, 50 tai 100 μl:aa ddH2O:ta. Näytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä minuutin ajan, minkä jälkeen niitä sentrifugoitiin 8000 rpm:ssä. Eluointi toistettiin.

DNA-konsentraation määritys

Näytteet laimennettiin lisäämällä niihin 90 μl:aa eluaationestettä ddH2O, jotta laimennossuhteeksi saatiin 1:10 ja valmista laimennosta olisi 100 μl:aa. Näytteet vorteksoitiin. Spektrofotometri (Pharmacia BioTech, GeneQuant) kalibroitiin 100 μl:lla ddH2O:ta, minkä jälkeen DNA-näytteistä mitattiin absorbanssi (A260), puhtaus, suhdeluku sekä proteiinimäärä. Mitatuista konsentraatioista laskettiin näytteen DNA-konsentraatio (A260 x laimennoskerroin x 50μg/ml). 18S rDNA-geenialueen monistaminen PCR-reaktiolla DNA-näytteet laitettiin jäille PCR-reaktioseoksen valmistuksen ajaksi. Näytteitä varten valmistettiin 10x premix pipetoimalla eppendorf-putkeen 395 μl ddH2O:ta, 50 μl 10 x puskuria, 20 μl dNTP-seosta, 10 μl aluketta 18S A1 ja 10 μl aluketta 18S A2. Seos vorteksoitiin ja spinnattiin, minkä jälkeen siihen lisättiin vielä 5 μl DNA-polymeraasia ja seosta naputeltiin ja se spinnattiin. PCR-putkiin pipetoitiin 49 μl:aa premixiä ja lopuksi lisättiin 1 μl templaatti-DNA:ta. Lisäksi tehtiin kontrolli PCR-seos, johon lisättiin templaatti-DNA:n sijasta vettä. Ennen PCR-laitteeseen asettamista seoksia naputeltiin. PCR-reaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa:

Vaihe	Lämpötila	Aika	Syklien määrä
Alkudenaturaatio	+95C	3-5 min	1
Denaturaatio	+95C	40s	30
Annealing	+57C	40s	30
Ekstensio	+72C	60s	30
Loppuekstensio	+72	5-10 min	1
Säilytys	+4C		1

RCR-reaktioiden tarkastelu agaroosigeelillä

RCR-reaktiotuotteiden tarkastelua varten valmistettiin 0,8% agaroosigeeli, johon lisättiin 0,005% etidiumbromidia, 1xTBE-puskuriin (250 ml TBE, 2,0g agaroosi, 12,5 μl EtBr). PCR-tuotteista valmistettiin näytteet geeliajoa varten (12 μl:aa PCR-näytettä, 2 μl BFB:tä sisältävää latauspuskuria). Geelille pipetoitiin 14 μl:aa varsinaisia PCR-näytteitä ja kontrollinäytteitä sekä 12 μl:aa molekyylipainomarkkeria (9 μl TE-puskuria 1 μl markkeira ja 2 μl latauspuskuria). Geeliä ajettiin 120V:n jännitteellä reilun tunnin ajan.

PCR-tuotteen puhdistaminen QlAquick PCR Purification Kit:in avulla

Noin 40 μl:n PCR reaktioon lisätiin 200 μl PB-puskuria ja näytteet vorteksoitiin. Näyteet pipetoitiin keräysputkessa olevaan QlAquick-pylvääseen. Putket laitetiin sentrifuugiin ja niitä sentrifugoitiin 13 000 rpm 1 min ajan. Pylvään läpi mennyt liuos heitettiin pois. Pylväs asetettiin takaisin samaan keräysputkeen ja pylvääseen lisätiin 750 μl pesupuskuria (PE), sentrifugoitiin uudelleen 13 000 rpm 1 min ajan. Pylvään läpi mennyt liuos heitetiin taas pois ja sentrifugoitiin vielä kerran 13 000 rpm 1 min ajan. Näytteiden sentrifugointi oli tärkeää, jotta puskurin sisältämä etanoli saataisiin tarkasti poistettua, silllä se voi häiritä sekvesointi-PCR-reaktion entsyymien työtä. Pylväät asetetiin puhtaisiin (2 ml:n) eppendorf-putkiin ja pylväiden membraaneille pipetoitiin 33 μl ddH2O. Näytteitä inkuboitiin 1 min huoneenlämmössä, minkä jälkeen näytteitä sentrifugoitiin 13 000 rpm minuutin ajan.

Sekvesointinäytteen valmistaminen ABI 3130XL-laitetta varten

Jokaisesta näytteestä siirrettiin 1,5 μl näytettä kahteen 0,5 ml:n eppendorf-putkeen (forward ja reverse). Sekvensointialukkeista (10pmol/ μl ) tehtiin laimennokset. Molemmat alukeliuokset laimennettiin lisäämällä 5 μl:aan alukkeetta 5 μl ddH2O oikean konsentraation saamiseksi. Näytteiden päälle pipetoitiin 1 μl sekvesointialuketta (5 pmol/ μl) siten, että toiseen putkeen tuli forwadr-aluketta ja toiseen reverse-aluketta. Sen jälkeen näytteiden päälle pipetoitiin 3 μl BigDye Terminator v3.1 -reaktioseosta, joka sisälsi leimaamattomat deoksinukleotiditrifosfaatit ja fluoresenssileimatut dideoksinukleotiditrifosfaatit, polymeraasi-entsyymin sekä puskuria. Lopuksi pipetoitiin vielä 4 μl laimennospuskuria sekä 10,5 μl ddH2O:ta, jotta lopputilavuudeksi saatiin 20 μl. Näytteitä naputeltiin ja lopuksi spinnattiin. Näyteet laitetiin PCR-koneseen (DTSEQ-ohjelma).

Saostusreaktiota varten valmistetiin ryhmälle yhteinen seos, johon laitetiin 40 μl 3M Na-asetaattia (pH=4,6), 1000 μl absolutoitua etanolia sekä 40 μl 125mM EDTA-liuosta. Liuosta sekoitetiin, minkä jälkeen 54 μl seosta pipetoitiin näytteiden päälle. Putkia sekoitetiin kääntämällä niitä pari kertaa. Putket asetettiin valmiiksi sentrifugiin saranpuolet ylöspäin, jotta tiedetään mihin sentrifugoinnin aikana muodostuva sakka tulee, ja niiden annettiin saostua huoneenlämmössä 20 min. Tämän jälkeen putkia sentrifugoitiin 13 000 rpm 30 min ajan. Neste poistettiin putkesta varovasti imulla välittömästi sentrifugoinnin jälkeen. Putkiin lisättiin 250 μl 70% alkoholia pesua varten ja sentrifugoitiin 13 000 rpm 5 min ajan. Alkoholi poistettiin varovasti. Putket laitettiin lämpökaappiin +55°C:een kannet auki (n. 15 min), jotta alkoholi haihtuisi näytteistä. Näytteiden päälle pipetoitiin 10 μl formamidia ja näytteet laitettiin sekvesointikoneeseen (ABI 3130xl Genetic Analyzer).

BioEdit ja Phylip Sekvensoinnista saatua dataa käsiteltiin BioEdit-ohjelmalla. Forward- ja reverse-alukkeilla tehtyjä sekvenssejä verrattiin toisiinsa ja N-arvon saaneet nukleotidit korjattiin kromatogrammin avulla oikeiksi, mikäli oikean nukleotidin päätteleminen oli mahdollista. NCBI:stä haettiin lisää sisä- ja ulkoryhmän sekvenssejä, minkä jälkeen esikäsitellyt sekvenssit koottiin ohjelmaan ja kaikki Sekvenssit kohdennettiin. Sekvenssien alku- ja loppupäistä poistettiin epäluotettavat alueet . Ulkoryhmänä käytettiin Homoptera-lahkon hyönteisistä saatuja sekvenssejä. Sekvenssit kohdennettiin, siten että eri sekvenssien välilä oli mahdollisimman vähän muuoksia, jotta nähdään alueet, joilla mutaatioita on tapahtunut. Aineisto tallennettiin muotoon, jota voitiin käyttää Phylip-ohjelmistolla. Lopullinen aineisto sisälsi seuraavien lajien sekvenssejä: Cimicomorpha: Nabis limbatus, Myrmedobia exilis, Orius Niger, Himacerus apterus, Himacerus boops, Anthocoris nemorus, Liocoris tripustulatus, Melymacra apicalis Pentatomomorpha: Myrmus miriformis, Nysius thymi, Alydus calcaratus, Elasmostethus interstinctus Leptopodo-morpha: Saldula grevicornis, Saldura saltatoria Gerromorpha: Gerris argentatum Nepo-morpha: Nepa cinerea Ulko-ryhmä: Hemiowoodwardia wilsoni Cryptococcus ulmi

Phylipillä rakennettiin eriliaisia puita: Neighbor joining, Parsimonia ja Maximum likelihood. Puita tarkasteltiin TreeView-ohjelmalla. Lisäksi käytettiin Bootsrap-menetelmää, jonka jälkeen rakennettiin myös bootsrap-aineistosta Neighbor joining-, Parsimonia- ja Maximum likelihood -puut.

Tulokset

DNA-konsentraation määritys DNA-näytteiden absorbanssin tulisi olla välillä 0,15-1,0, jotta lukemaa voidaan pitää luotettavana. Absorbanssimittauksessa kolmessa neljästä näytteessä oli tarpeeksi suuri absorbanssi (taulukko 1). DNA:n eristys oli onnistunut hyvin, sillä näytteiden puhtaus oli hyvä, eikä näytteissä ollut proteiinia. Epäpuhtauksia oli kuitenkin hieman sillä näytteiden suhdearvot eivät osuneet välille 1,8-2.

PCR PCR:n onnistumista tarkisteltiin ajamalla PCR-tuotteita elektroforeesilla. Ylärivillä ajetut PCR:t olivat onnistuneet kaivon 6 näytettä lukuun ottamatta (kuva 1). Kontrollikaivossa 10 ei näy DNA:ta, joten PCR on onnistunut eikä siinä ole tapahtunut kontaminaatiota. Alarivillä sen sijaan ei yhdessäkään kaivossa näy PCR-tuotetta, mutta ladder näkyy, joten alarivin käyttämässä PCR-reaktioseoksessa on ollut jotain vikaa. On mahdollista, että PCR-liuokseen laitettiin samaa aluketta kaksi kertaa. DNA:n puuttumiseen voi myös vaikuttaa se, ettei PCR-reaktioliuos ollut jäillä koko aikaa, jolloin entsyymine teho on saattanut heiketä.

Fylogenia puut Bootstrap-menetelmällä rakennetut parsimonia ja maximum likely hood –puut ovat hyvin samanlaisia (kuvat 2 ja 3). Kummassakin puussa Himacerus boops on Pentatomomorphan infraluokassa, vaikka sen kuuluisi olla Cimicomorphan infraluokassa, kuten Himacerus apterus.

Taulukko 1 Taulukkoon on merkitty absorbanssimittauksen yhteydessä saadut tulokset. Kaikissa muissa paitsi yhdessä absorbanssi oli tarpeeksi korkea.

Näyte	A260	ratio	purity	protein	konsentraatio
Myrmedobia exilis	0,025	1,718	0,95	0	12,5
Myrmus miriformis	0,165	1,647	0,91	0	82,5
Stenodema laevigatum	0,243	1,714	0,95	0	121,5
Himacerus apterus	0,337	1,697	0,94	0	168,5

Tarkastelu

Tulostemme perusteella...