FYLOGENIA Sanna & Johanna
Wikicampus
Sisällysluettelo |
Onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-hyönteislahkossa?
Johanna Lehto ja Sanna Pausio
Tiivistelmä
Heteroptera-hyönteislahko on on monimuotoinen ryhmä, jonka fylogenia on kiistanalainen. Osalla sen alalahkoista on havaittu akiasmaattista meioosia, jossa homologisten kromosomien välillä ei tapahdu rekombinaatiota. Työmme tarkoituksena oli selvittää, onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-hyönteislahkossa. Eristimme hyönteismateriaalista DNA:ta, josta sekvensoitiin ribosomin 18S-alayksikköä koodittava alue. Käytössämme oli myös valmista Heteroptera-lajien 18S-sekvenssitietoa. Rakensimme sekvenssitietojen perusteella Heteroptera-lahkolle fylogeniapuut parsimonia-, neighbor joining- ja maximum likelihood-menetelmillä. Saamamme tulokset eivät tue hypoteesia akiasmaattisen meioosin monofyleettisyydestä Heteroptera-lahkossa.
Johdanto
Hyönteislahko Heteroptera (erilaissiipiset) on monimuotoinen ryhmä, johon kuuluu herbivoreja, petoja ja parasiitteja. Lahkon edustajat käyttävät erityyppisiä elinympäristöjä akvaattisista terrestrisiin. Heteroptera-lahkoon kuuluu noin 40 000 lajia, joista noin 800 esiintyy Suomessa. Lahko on jaoteltu morfologisten ominaisuuksien perusteella seitsemään alalahkoon, joista viisi - Nepomorpha (esim. vesiskorpionit), Gerromorpha (esim. vesimittarit), Leptopodomorpha, Cimicomorpha (esim. lutikka) ja Pentatomomorpha (esim. marjalude) - esiintyy Suomessa.
Heteroptera-lahko muodostaa yhdessä Homoptera-lahkon (yhtäläissiipiset) kanssa ylälahkon Hemiptera (nivelkärsäiset), joka puolestaan kuuluu suurimpaan monofyleettiseen hyönteiskohorttiin nimeltä Paraneoptera. Kohortin kaikilla jäsenillä on holokineettinen kromosomisto. Holokineettisestä kromosomista puuttuu sentromeeri, jolloin sukkularihmat kiinnittyvät meioosissa koko kromosomin pituudelle.
Osalla Heteroptera-lahkon jäsenistä esiintyy akiasmaattista meioosia. Siinä homologisten kromosomien välille ei synny crossing-overeita, minkä vuoksi kromosomien välillä ei tapahdu rekombinaatiota. Ominaisuus on eliökunnassa polyfyleettinen ja sitä esiintyy ainoastaan heterogameettisella sukupuolella, joka Heteroptera-lahkon jäsenillä on koiras. Heteroptera -lahkossa akiasmaattinen meioosi on löydetty alalahkoista Nepomorpha, Leptopodomorpha ja Cimicomorpha.
Heteroptera-lahkon fylogenia on kiistanalainen, sillä monet karyosystemaattiset markkerit, kuten meioosityyppi sekä sukupuolikromosomit ja niiden käyttäytyminen, vaihtelevat lahkon sisällä. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää, onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-lahkossa.
Aineisto ja menetelmät
Materiaali
Heteroptera-lahkon sisäisten sukulaisuussuhteiden arvioimiseen käytettiin ribosomaalista RNA:ta koodaavan 18S-DNA:n sekvenssitietoa. Aineistomme käsitti alkoholiin säilöttyä hyönteismateriaalia kuudentoista Cimicomorpha-, Gerromorpha-, Pentatomomorpha- ja Nepomorpha-alalahkoihin kuuluvan lajin osalta (taulukko 1). Lisäaineistona käytettiin valmiita sekvenssejä yhdentoista lajin osalta. Näistä yhdeksän Leptopodomorpha-, Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha-alalahkoihin kuuluvan lajin 18S-DNA oli sekvensoitu aiemmilla kursseilla (taulukko 1). Lisäksi kahden lajin 18S-sekvenssitiedot haettiin NCBI:n GenBankista. H. boops-lajin DNA-jakso oli sekvensoitu aiemmin museonäytteestä. Ulkoryhmäksi valittiin Homoptera-lahkoon kuuluva H. wilsoni. Kaiken kaikkiaan puiden rakentamisessa käytettiin neljään eri heteroptera-alalahkoon kuuluvia sekvenssejä, joista kolmesta oli mukana vain yksi edustaja. Heimotasolla kahdesta heimosta mukana oli enemmän kuin yhden lajin sekvenssi. Yksi sekvensseistä, N. limbatus, editoitiin kahteen kertaan, kahden eri editoijan toimesta.
DNA eristettiin hyönteismateriaalista Qiagen DNeasy Tissue Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti, minkä jälkeen näytteiden DNA-konsentraatio määritettiin spektrofotometrillä (Pharmacia BioTech, GeneQuant). 18S rDNA-geenialue monistettiin PCR-reaktiolla. PCR-tuotteet puhdistettiin QIAquick PCR Purification Kit:in avulla kitin ohjeiden mukaisesti. Näytteet sekvensoitiin ABI 3130XL-laitteella.
DNA:n eristys
Eristys aloitettiin jauhamalla n. 50 mg nestetypessä jäädytettyä hyönteismateriaalia hienoksi. Näytteeseen lisättiin ATL -puskuria ja sekä proteinaasi K:ta. Näyte sekoitettiin vorteksoimalla ja sitä inkuboitiin 55 C parin tunnin ajan, minkä jälkeen näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Näytteeseen lisättiin AL-puskuria, näyte sekoitettiin ja inkuboitiin 10 min. Näytteeseen lisättiin etanolia ja näyte sekoitettiin vorteksoimalla. Seos pipetoitiin DNeasy -minipylvääseen, jonka membraanille DNA tarttui. Muut aineet poistettiin pylväästä sentrifugoimalla. Minipylväs asetettiin uuteen putkeen ja siihen kiinni jäänyt DNA pestiin lisäämällä pylvääseen AW1 -puskuria ja sentrifugoimalla, minkä jälkeen pesu toistettiin käyttäen AW2 -puskuria. DNA:ta sisältävä pylväs asetettiin eppendorfputkeen ja DNA irrotettiin siitä ddH2O:lla. Eluointitilavuus riippui näytteen sisältämästä DNA:n määrästä ja vaihteli 25 mikrolitrasta 100 mikrolitraan. Vesi pipetoitiin suoraan membraanille, inkuboitiin huoneenlämmössä 1 min ja näyte sentrifugoitiin, minkä jälkeen eluointi toistettiin.
DNA:n konsentraation määrittäminen
Puhdistetusta näytteestä määritettiin DNA -pitoisuus spektofotometrillä käyttäen aallonpituuden 260 nm absorbanssia.
Absorbanssin mittaamista varten näytteestä tehtiin 1:10 laimennos eluaationesteeseen. Tätä varten eppendorfputkeen pipetoitiin 10 mikrolitraa DNA:ta ja 90 mikrolitraa ddH2O:, jotka sekoitettiin vorteksoimalla. Spektrofotometri kalibroitiin ddH2O:lla. Tämän jälkeen näytelaimennokset pipetoitiin vuorotellen laitteen kyvettiin. Ollakseen luotettava absorbanssilukeman pitäisi osua välille 0.15 - 1.00. Absorbanssin lisäksi laite ilmoittaa myös näytteen ratio?, puhtauden prosentteina ja proteiinikonsentraation. Absorbanssin ja laimennoskertoimen avulla voidaan laskea näytteen konsentraatio, kaavalla A260*laimennoskerroin*50mikrogrammaa/ml.
PCR-reaktio
Näytteestä monistettiin noin 500 emäsparin mittainen 18S-DNA-jakso PCR-reaktiolla. Tätä varten valmistettiin tilavuudeltaan 50 mikrolitran reaktioseos. Kahdeksaa näytettä varten valmistettiin yhteinen premix 10* tilavuudella, jotta voitiin tehdä myös kontrollinäyte ja jättää pipetointivaraa. Premixiin laitettiin järjestyksessä 395 mikrolitraa ionisoitua vettä, 50 mikrolitraa 10*puskuria, 20 mikrolitraa deoksinukleotideja, joita seoksessa on yleensä yhtä paljon kaikkia, sekä 10 mikrolitraa sekä reverse- että forward -aluketta. Nämä sekoitettiin vorteksoimalla ja spinnattiin. Seokseen lisättiin 5 mikrolitraa DNA -polymeraasientsyymiä, joka sekoitettiin varovasti naputtelemalla jotta se pysyisi toimintakykyisenä. Seos spinnattiin. Premixiä pipetoitiin 49 mikrolitraa eppendorfputkeen ja lisättiin 1 mikrolitra näytettä templaatti-DNA:ksi, kontrolliputkeen lisättiin vettä. Reaktioseos sekoitettiin varovasti naputtelemalla. DNA monistettiin PCR:llä taulukon 2 (PCR-reaktio.xls)mukaisesti. Alukkeiden sulamislämpötilat laskettiin kaavalla Tm = 4 x (G+C)° + 2 x (A+T)°, mistä laskettiin annealing-lämpötilat kaavalla Tann = Tm - 5. Forward- ja reverse-alukkeiden annealing-lämpötiloiksi saatiin 57 °C ja 65 °C.
PCR-tuote puhdistettiin QIAquick PCR purification kitin avulla. PCR-reaktioon lisättiin viisinkertainen määrä 200 mikrolitraa PB-puskuria. Näyte pipetoitiin pylvääseen ja sentrifugoitiin. Pylvääseen lisättiin 750 mikrolitraa pesupuskuria. Pylväs sentrifugoitiin kahteen kertaan ja DNA eluoitiin pylväästä steriilillä vedellä tilavuuteen 33 mikrolitraa.
DNA:n määrittäminen PCR-tuotteesta
PCR-reaktion onnistuminen varmistettiin ajamalla reaktiotuote 0.8% agaroosigeelillä. Geeli valmistettiin liuottamalla 250 ml 1*TBE-puskuria 2.0 g agaroosia kuumentamalla mikroaaltouunissa kunnes seos kirkastui. Seos jäähdytettiin koko ajan sekoittaen n. 60 C ja siihen lisättiin 0.005% etydiumbromidia 12.5 mikrolitraa. Etydiumbromidi sitoutuu DNA:han ja värjää sen näkyväksi UV-valossa. Geeli kaadettiin tarjottimelle ja siihen asetettiin kaksi kampaa, niin että kaivoja tuli kahteen riviin. Ajonäytteet valmistettiin pipetoimalla PCR-reaktioista eppendorfputkeen 12 mikrolitraa PCR-tuotetta ja 2 mikrolitraa bromophenolblueta sisältävää latauspuskuria. Geeli peitettiin 1*TBE-puskurilla ja näytteet ladattiin kaivoihin. Kummallekin riville ladattiin myös molekyylipainomarkkeri, joka valmistettiin sekoittamalla 9 mikrolitraa TE-puskuria, 1 mikrolitraa markkeria ja 2 mikrolitraa latauspuskuria, sekä negatiivinen kontrolli, jossa oli 10 mikrolitraa TE-puskuria ja 2 mikrolitraa latauspuskuria. Geeliä ajettiin 120 V jännitteellä yli tunnin ajan.
Sekvensointi
Sekvensointia varten näytteestä tehtiin sekvensointi-PCR-reaktio erikseen sekä forward- että reverse-alukkeelle. Sekvensointinäyte valmistettiin pipetoimalla 1.5 mikrolitra tilavuudeltaan olevan näytteen päälle 1 mikrolitra sekvensointialuketta, 3 mikrolitraa BigDye Terminator v3.1 -reaktioseosta, joka sisältää leimaamattomat ja fluoresenssileimatut nukleotidit, polymeraasientsyymin ja puskuria, sekä 4 mikrolitraa laimennospuskuria. Reaktio täytettiin 20 mikrolitran tilavuuteen steriilillä vedellä, jota tässä tapauksessa käytettiin 10.5 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin naputtelemalla. Näyte spinnattiin ja asetettiin PCR-koneeseen, joka oli ohjelmoitu edellä kuvatulla tavalla.
Sekvensointinäyte puhdistettiin keräämällä DNA pelletiksi. Saostusreaktiota varten valmistettiin seos, johon sekoitettiin 40 mikrolitraa NA-asetaattia, 1000 mikrolitraa etanolia ja 40 mikrolitraa 125 mM EDTA-liuosta. Kunkin näytteen päälle pipetointiin seosta 54 mikrolitraa. Näyte sekoitettiin kääntelemällä. Saostusseoksen annettiin vaikuttaa 20 minuuttia, jonka jälkeen DNA kerättiin pelletiksi putkeen sentrifugoimalla 13 000 rmp 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen saostusseos poistettiin putkesta imulla. Tämän jälkeen DNA pestiin 70% alkoholilla, putki sentrifugoitiin ja alkoholi imettiin pois. Putki laitettiin vielä kansi avoimena lämpökaappiin, minkä jälkeen näytteet pakastettiin.
Sekvensointia varten näyte suspensoitiin 10 mikrolitraan formamidia. Näytteet pipetoitiin kuoppalevylle, joka ladattiin sekvensointilaitteeseen, minkä jälkeen laite käynnistettiin.
Sekvensointi ABI 3130xl Genetic Analyzer-laitteen avulla perustuu elektroforeesiin. Laite erottelee elektroforeesin avulla eri pituiset DNA-jaksot ja lukee kunkin jakson päättävän nukleotidin leiman. Laite tallettaa sekvenssin tiedot tietokoneohjelmaan, josta ne voidaan viedä analysoitaviksi toisiin ohjelmiin. Tiedostoon tulostuu sekä sekvenssin emäsjärjestys että kromatogrammi, jonka perusteella emäsjärjestys on rakentunut.
Osasta DNA-näytteitä ei saatu sekvenssejä ilmeisesti PCR-premixissä tapahtuneen pipetointivirheen vuoksi. Puuttuvia sekvenssejä korvattiin aiemmalla sekvenssitiedolla.
Sekvenssien tarkastelu
Sekvenssit tuotiin BioEdit-ohjelmaan. Saman näytteen forward- ja reverse-alukkeilla monistetut sekvenssit kohdennettiin. Reverse-juosteen sekvenssi käännettiin vastaamaan forward-juosteen sekvenssiä. Myös kromatogrammi käännettiin. Tämän jälkeen valittiin sequence - pairwise aligment -align two sequences (allow ends to slide), mikä kohdensi sekvenssit. Uusi tiedosto tallennettiin, minkä jälkeen sitä editoitiin.
Sekvensseistä etsittiin emäkset, joita sekvenssointiohjelma ei ollut pystynyt määrittämään. Mikäli yhdessä juosteessa oli tunnistamaton emäs, se pystytiin tunnistamaan vastinjuosteen tietojen perusteella. Mikäli molemmissa juosteissa oli samassa kohtaa tunnistamaton emäs tai vastinjuosteiden tiedot olivat keskenään ristiriitaiset, kromatogrammista tutkittiin, minkä emäksen emissiokäyrä missäkin kohdassa oli korkein. Mikäli kromatogrammistakaan ei pystynyt määrittämään emästä, sen tieto jäi puuttumaan sekvenssistä. Kummankin juosteen loppupäässä oli yleensä huonoa sekvenssiä, joka sisälsi runsaasti epävarmoja emäksiä ja pseudosekvenssiä. Tällaiset jaksot leikattiin pois valmiista sekvenssistä.
Kun sekvenssit oli editoitu, niiden tiedot yhdistettiin samaan tiedostoon. Tästä tiedostosta poistettiin forward- ja reverse-sekvenssit ja nimettiin contig-sekvenssi näytteen nimellä. Kun kaikkista sekvensseistä oli tehty contig-tiedostot, ne tuotiin samaan tiedostoon ja kohdennettiin keskenään.
Samaan tiedostoon haettiin myös muutamia Heteroptera-ryhmän lisäsekvenssejä geenipankista sekä Homoptera-ryhmään kuuluva ulkoryhmän edustaja Hemiowoodwardia wilsoni. Lisäsekvenssit edustivat 18S rDNA-sekvenssijakson sisällä samaa emäsjaksoa kuin alkuperäiset sekvenssit. Emäsjaksot kopioitiin GenBankista muodosta Fasta-formaatissa, minkä jälkeen ne liitettiin tiedostoon ja kohdennettiin. Uusi tiedosto tallennettiin. Lopulliseksi lajimääräksi tuli 15 (sisältäen yhden ulkoryhmää edustavan lajin).
Ohjelman tekemät kohdennukset tarkistettiin ja niitä editoitiin sen mukaan, millainen mutaatio edellytti vähiten muutoksia kaikkien sekvenssien tasolla kun emäkset asetettiin mahdollisimman hyvin kohdakkain. Kohdennukset leikattiin muutaman emäksen tarkkuudella saman pituisiksi. Kohdennetusta aineistosta luotiin input-tiedosto fylogeniapuiden rakentamista varten kopioimalla sekvenssit Note pad-ohjelmaan.
Puiden luominen
Puut rakennettiin Phylip-ohjelmistolla. Ohjelmisto on komentopohjainen ja lukee note pad -ohjelman tekstitiedostoja. Ennen puunrakennusohjelmiin viemistä sekvenssitiedoston pääte poistettiin. Tämän jälkeen ohjelmat pystyivät avaamaan infile-tiedoston. Ohjelmissa määritettiin aineiston muodoksi sequential. Kaikissa puunrakennusohjelmissa määritettiin myös ulkoryhmä sekvenssin järjestysnumeron perusteella. Ulkoryhmän perusteella ohjelmat pystyivät määrittämään sekvenssien alkuperäiset ominaisuudet.
Neighbor joining-puuta varten aineistosta tehtiin etäisyysmatriisi dnadist.exe-ohjelmalla ja puu rakennettiin neighbor.exe-ohjelmalla. Neigbour joining -menetelmä perustuu parittaisten geneettisten etäisyyksien laskemiseen näytteiden välillä. Mikäli sekvenssit ovat täysin samanlaiset, etäisyys on nolla. Tätä varten aineistosta täytyy rakentaa etäisyysmatriisi. Matriisista yhdistetään ensin näytteet, joiden geneettinen etäisyys on pienin. Tämän jälkeen etsitään seuraavaksi lähimpänä toisistaan oleva pari, mukaan luettuna lähimmän parin keskiarvo. Näin jatketaan, kunnes kaikki sekvenssit on yhdistetty puuhun. Tuloksena on yksi puu.
Parsimonia-puu rakennettiin DNApars.exe-ohjelmalla. Parsimonia-menetelmä perustuu ominaisuusmatriisiin. DNA-sekvenssejä tutkittaessa jokainen emäs muodostaa yhden ominaisuuden. Menetelmässä tutkitaan vain informatiivisiä ominaisuuksia, eli ominaisuuksia jotka muuntelevat tutkittavien näytteiden välillä. Ominaisuuksien perusteella rakennetaan useita puita. Puista valitaan ne, joiden toteutumiseen on tarvittu vähäisin mahdollinen määrä muutoksia ominaisuuksissa. Tällainen puu on aina myös lyhin. Lyhimmän puun etsimiseen on mahdollista käyttää useita eri optimaalisuuskriteerejä. Sekvenssiaineiston kohdalla käytetään yleensä Fitchin kriteeriä, jossa yksi tapahtunut muutos lasketaan aina saman arvoiseksi ja ominaisuuksien takaisin muuntuminen on sallittua. Parsimonia-menetelmässä tuloksena saattaa olla useita yhtä lyhyitä puita.
Maximum likelihood-puu rakennettiin DNAml.exe-ohjelmalla. Menetelmä perustuu todennäköisyyteen tavata kerätty aineisto jonkin hypoteesin vallitessa. DNA -sekvenssien tapauksessa hypoteesin muodostavat yhdessä evoluutiomalli ja rakennettu puu. Maximum likelihood -menetelmässä aineistosta luodaan ensin yksi puu jollain helpolla menetelmällä. Liikkeelle voidaan lähteä esim. parsimonia-menetelmällä koostetusta puusta, jota lähdetään optimoimaan. Koska aineiston lisäysjärjestys vaikuttaa menetelmän lopputulokseen, se arvotaan yleensä useita kertoja. (jumble)
Fylogeniapuiden luotettavuuden arvioimiseksi aineisto satunnaistettiin bootstrap-menetelmällä seqboot.exe-ohjelmalla. Bootstrap-menetelmässä aineistosta luodaan uusia toistoja leikkaamalla aineiston sarakkeet irti toisistaan ja järjestelemällä ne uudelleen satunnaiseen järjestykseen, jolloin samat ominaisuusyhdistelmät toistuvat uudelleen satunnaisessa järjestyksessä. Aineistosta luotiin tuhat uutta toistoa. Bootstrap-aineistosta rakennettiin neighbor joining-, parsimonia- ja maximum likelihood-puut edellä kuvatulla menetelmällä. NJ- ja parsimonia-menetelmässä puut luotiin tuhannesta toistosta, mutta ML-menetelmässä sen hitauden vuoksi toistoja annettiin vain 100.
Saaduista puista rakennettiin konsensuspuut consense.exe-ohjelmalla. Puut rakennettiin kullakin menetelmällä luoduille bootstrap-puille erikseen. Konsensuspuiden rakentamisen tarkoituksena oli koota bootstrap-puista yksi puu, joiden oksanhaarojen todennäköisyysarvot määräytyivät sen perusteella, miten monissa bootstrap-puissa oksat haarautuivat samalla tavalla.
Puiden tarkasteluun käytettiin TreeView-ohjelmaa.
Taulukko 1. Fylogeniapuissa käytetyt Heteroptera-lajit. Homoptera-lahkoon kuuluvaa lajia Hemiowoodwardia wilsoni käytettiin ulkoryhmänä.
Tulokset
Eri menetelmillä koostetut konsensuspuut erosivat jonkin verran sekä toisistaan että morfologisten ominaisuuksien perusteella koostetusta erilaissiipisten fylogeniasta. Homogeenisimmin eri puissa sijoittuivat Cimicomorpha- ja Pentatomomorpha- alalahkojen lajit, joita aineistossa myös oli eniten.
Kaikissa puissa alalahkon Cimicomorpha- jäsenet muodostivat oman ryhmänsä, lukuun ottamatta H. boops-lajia, joka sijoittui kaikissa puissa samaan haaraan Pentatomomorpha- alalahkon edustajien kanssa, vaikka todellisuudessa kuuluukin Cimicomorpha- ryhmään. Parsimonia-menetelmällä koostetussa puussa myös O. niger sijoittui erilleen Cimicomorpha- alalahkosta, samaan haaraan Nepomorpha- alalahkon edustajan kanssa. Pentatomomorpha-alalahkon jäsenet sijoittuivat kaikissa puissa samaan ryhmään.
Heimotasolla aineistossa oli vain kaksi ryhmää, joista oli enemmän kuin yksi edustaja. Kaikissa puissa M. exilis ja A. nemorum sijoittuivat samaan haaraan, vaikka A. nemorum kuuluu samaan heimoon lajin O. niger kanssa. Tosin haarautumiskohdan bootstrap-arvo on kaikissa puissa melko alhainen. O. niger oli maximum likelihood- ja neigbour joining-puissa sijoittunut muualle Cimicomorpha-alalahkoon. Toinen heimotason ryhmä, Nabidae, oli sijoittunut kaikissa puissa yhteen samaksi ryhmäksi H. boops-lajia lukuun ottamatta.
Aineiston ainut kahteen kertaan käytetty sekvenssi, N. limbatus, sijoittui kaikissa puissa yhtenevästi, tosin vain maximum likelihood-puussa sen bootstrap-arvo oli täydet sata.
Kaikissa konsensuspuissa S. saltatoria (alalahko Leptopodomorpha, akiasmaattinen meioosi) erkaantui aikaisemmin ryhmästä, josta myöhemmin kehittyivät alalahkot Cimicomorpha (akiasmaattinen meioosi) ja Pentatomomorpha (kiasmallinen meioosi). Lisäksi maximum likelihood-konsensuspuussa S. saltatoria sijoittui samaan ryhmään lajin G. argentatum (alalahko Gerromorpha, kiasmallinen meioosi) kanssa.
Kuva 1. Parsimoniakonsensuspuu.
Kuva 2. Neighbor joining-konsensuspuu.
Kuva 3. Maximum likelihood-konsensuspuu.
Tarkastelu
Tässä harjoitustyössä koostetut puut vastasivat pääosin yleistä käsitystä aineistossa olevien lajien sukulaisuussuhteista. Suurimmat erot todelliseen tilanteeseen olivat lajien H. boops ja O. niger sijoittumisessa. Tässä aineistossa oikeimmat ja keskenään samankaltaisimmat tulokset saatiin maximum likelihood- ja neighbor joining -menetelmillä.
Jotkin lajit sijoittuivat vääriin kohtiin puita luottamusarvoilla, joita voidaan pitää hyväksyttävinä. Tämä johtuu todennäköisesti käytetyn menetelmän rajoitteista. Puut tehtiin vain noin 300 emäsparin sekvenssistä, joka on hyvin pieni osa tutkitun eliöryhmän koko perimää. Vaikka tutkittu alue sisältääkin sekä konservoituneita että varioivia jaksoja, näin pieni otos ei anna täysin luotettavaa kuvaa lajien genomien samankaltaisuudesta. Lisäksi otos on yhdestä kohtaa genomia, joten se edustaa tilannetta vain yhden geenijakson kohdalla. DNA-sekvenssien perusteella tehdyt fylogeniat eroavat usein jossakin määrin morfologisin perustein tehdyistä fylogenioista.
Lajin H. boops sekvenssi saatiin museonäytteestä, mikä on saattanut vaikuttaa sen sijoittumiseen oman alalahkonsa ulkopuolelle kaikissa konsensuspuissa.
Tämän työn tulokset eivät tue hypoteesia akiasmaattisen meioosin monofyleettisyydestä Heteroptera-lahkossa, sillä tämän aineiston mukaan akiasmaattinen meioosi on syntynyt erikseen sekä Cimicomorpha että Leptopodomorpha-alalahkoissa. Jotta piirrettä voitaisiin pitää monofyleettisenä, Leptopodomorpha- ja Cimicomorpha-alalahkojen pitäisi sijaita samassa haarassa. Tässä työssä luoduissa puissa S. saltatoria-laji ja Cimicomorpha-alalahkon edustajat sijaitsevat eri haaroissa.
Lähteet
Ahmad, I., Moizuddin, M. A revision of Acanthosomatidae (Hemiptera: Pentatomomorpha: Pentatomoidea) from Indo-Pakistan area with a cladistic analysis of the genera. Oriental Insects 1990; 24: 267-304.
http://tolweb.org/Nepomorpha/10814
http://tolweb.org/tree?group=Hemiptera
http://www.catalogueoflife.org/show_species_details.php?record_id=670889
