FYLOGENIA Noora & Suvi
Wikicampus
Otsikko: Onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-hyönteislahkossa
Tekijät: Suvi Aromaa ja Noora Hirvonen
Sisällysluettelo |
Tiivistelmä
Tutkimme DNA-sekvensseistä rakentamiemme sukupuiden avulla onko akiasmaattinen meioosi mono- vai polyfyleettinen ominaisuus Heteroptera-hyönteislahkossa. Tutkimuksessa käytimme itse tuottamiamme sekvenssejä ja NCBI-tietokannasta löydettyjä ulkoryhmäläisten sekvenssejä kontrollimielessä.
Eristimme itse luteiden Nepa cinerea, Orius niger, Corixidae sp. ja Myrmedobia exilis DNA:ta, monistimme siitä ribosomaalista sekvenssialuetta 18S PCR-reaktiolla ja sekvensoimme alueet.
Valmiita sekvenssejä editoitiin tietokoneohjelmilla, ja niistä rakennettiin PHYLIP-ohjelmiston avulla estimaattisia fylogeniapuita, joista lopulta arvioitiin konsensuspuut Maximum likelihood-, Neighbor joining- ja Parsimonia-menetelmillä. Näistä kolmesta sukupuusta pystyimme varovasti arvioimaan kirjallisuuteen vertaamalla akiasmaattisen meioosin monofyleettisyyden Heteroptera-lahkossa.
Vertasimme myös alalahkojen keskinäisiä suhteita saamissamme tuloksissa ja vertasimme niitä kirjallisuudessa esitettyyn, morfologisin keinoin rakennettuun, Heteroptera-lahkon sukupuuhun. Totesimme ainakin alalahkon Cimicomorpha yhtenäisyyden omana alalahkonaan, ja sen etäisyys muihin ryhmiin oli yhtäpitävä kirjallisuuden kanssa. Otoksemme toisista alalahkoista olivat puutteellisia tai virheellisiä.
Johdanto
Tutkimus on osanen laajempaa kokonaisuutta, jonka tarkoitus on selvittää Paraneoptera-hyönteiskohortin sisäisiä molekyylifylogenisiä suhteita. Kohorttiin kuuluvat lahkot Thysanoptera, Homoptera, Heteroptera, Psocoptera ja Phithiraptera, joilla kaikilla on holokineettiset kromosomit eli sentromeeri on jakautunut tasaisesti koko kromosomin pituudelle eikä lokalisoitunut vain yhteen kohtaan. Heteroptera (erilaissiipiset)- ja Homoptera (yhtäläissiipiset)-lahkot muodostavat yhdessä ylälahkon Hemiptera (nivelkärsäiset).
Tutkimamme Heteroptera-lahkonkin sisäinen järjestys on kiistanalainen. Lahko on morfologisesti hyvin monipuolinen ja sen sisäisestä järjestyksestä alalohkoihin on erilaisia hypoteeseja. Nykyisellään se jaetaan seitsemään alalahkoon. Yritimme selvittää eristämiemme DNA-sekvenssien avulla koiraan akiasmaattisen meioosin mono- tai polyfyleettisyyttä määrittämällä lahkolle todennäköisiä sukupuita. Kirjallisuudesta tiesimme millä lajeilla kyseisen tyyppinen meioosi esiintyy.
Akiasmaattisessa meioosissa homologisten kromosomien välille ei synny kiasmoja, ja se esiintyy aina heterogameettisella sukupuolella; Heteroptera-lahkon tapauksessa koirailla. Evolutiivisesti akiasmaattinen meioosi on hyvin polyfyleettinen ominaisuus eli se on syntynyt evoluution aikana useita kertoja. Se on erittäin käytännöllinen molekyylimarkkeeri selvitettäessä lajien sukulaisuussuhteita.
Aineisto ja menetelmät
Aineistonamme oli etanoliin säilöttyjä hyönteisnäytteitä Heteroptera-lahkon lajeista; jokainen työpari sai neljä lajia, jotka meillä olivat Orius niger, Nepa cinerea, Myrmedobia exilis ja Corixidae sp. Emme kuitenkaan onnistuneet saamaan riittävää DNA-saantoa Corixidae sp. -ryhmän luteesta, joten tämä lude jätettiin pois tutkimuksesta. Saimme tilalle toisen samaan ryhmään kuuluvan luteen, Micronecta scholtzi. Fylogeniapuiden rakentamisessa käytimme siis myös muiden ryhmäläisten tuottamia sekvenssejä samaisen lahkon lajeista. Lisäksi haimme internet-tietokanta NCBI:sta Homoptera-lahkoon kuuluvien lajien Hemiowoodwardia wilsoni ja Cryptococcus ulmi sekvenssit ulkoryhmiksi.
Eristimme saamistamme näytteistä DNA:ta Qiagen DNeasy™ Tissue Kit:n avulla ja paketista löytyvien ohjeiden mukaisesti. Eristämisen jälkeen tarkistimme spektrofotometrillä näytteen DNA-konsentraation ja tarvittaessa laimensimme näytteitä PCR-reaktiota varten. PCR-näytteen konsentraation tulisi olla noin 50 µl/ml.
Vertailua varten kaikista DNA-näytteistä monistettiin 18S rDNA-alueen sekvenssi PCR-reaktiolla, jonka lämpötilat ja syklien määrät suunnittelimme itse monisteen avulla. Saadut PCR-näytteet ajettiin elektroforeesigeelin läpi varmistaaksemme PCR-reaktion tapahtuneen onnistuneesti. Agaroosigeeliin lisätty etidiumbromidi tarttuu DNA:han ja fluoresoi UV-valossa, joten pystyimme arvioimaan DNA-kokomarkkerin avulla näytteemme koon ja oikeellisuuden. PCR-reaktiotuotteet puhdistettiin QIAquick PCR Purification Kit:n avulla monisteen ohjeiden mukaisesti.
Sekvensointinäytteen valmistaminen ABI 3130XL Genetic Analyzer -laitetta varten aloitettiin sekvensointi-PCR-reaktiolla monisteen ohjeiden mukaan. Saadut tuotteet puhdistettiin sekvensointi-PCR:n jäljiltä ylijääneistä alukkeista ja nukleotiditrifosfaateista. Tämän jälkeen puhdistetut sekvensoitavat näytteet voitiin vihdoin ladata sekvensointilaitteeseen kokeneemman laboratorityöntekijän avustuksella. Laitteen käyttöohjelmaan asetettiin sekvensoinnin tiedot ja asetettiin säädöt oikeiksi monisteen tietojen mukaisesti.
Saimme sekvensointitulokset sähköisessä muodossa ja siirryimme työskentelemään tietokoneille. Editoimme sekvenssejä BioEdit-ohjelmalla poistamalla huonot nukleotidipätkät ja arvioimalla epäselviä nukleotideja vertaamalla komplementaarisia juosteita toisiinsa. Editoinnin jälkeen kohdensimme kaikki käytettävät sekvenssit ja katkaisimme ne siten, että jokainen verrattava sekvenssialue olisi samasta kohdasta. Tässä vaiheessa etsimme NCBI-webtietokannasta kahden ulkoryhmäläisen sekvenssit ja leikkasimme ne samalta alueelta kuin omat näytteemme. Käytimme aiemmin mainittuja Homoptera-lahkon jäseniä.
Tämän jälkeen siirsimme siistityt sekvenssit Notepad-ohjelmaan, jolla ne muokattiin PHYLIP-puunrakennusohjelmistoa varten sopivaan muotoon. Teimme Neighbor Joining-, Parsimonia- ja Maximum Likelihood -puut, joista sittemmin käsittelyn jälkeen Bootstrap-ohjelmalla kokoavat consensus-puut. Neighbor joining -toiminto liittää yhteen lajeja sen perusteella millä on pienin välimatka mitattuna pistemutaatioina ja kokoaa näin tulosteena kaikkein yleisimmän vaihtoehdon. Parsimonia-menetelmä arvioi mikä puu saadaan aikaan selittämällä kohdennuksessa esiintulevat erot mahdollisimman pienin muutoksin; se laskee tällaisia puita pyydetyn määrän (yleensä satoja) ja antaa tulokseksi kaikkein kitsaimmin muutoksia sisältävän vaihtoehdon. Maximum likelihood -menetelmä antaa tulokseksi evolutiivisesti kaikkein todennäköisimmän puuvaihtoehdon; se perustuu aina johonkin evoluutioteoriaan. ML-menetelmä on näistä kenties kaikkein joustavin ja siten ehkä paras näistä vaihtoehdoista. Paras lopputulos kuitenkin saadaan vertaamalla kaikilla menetelmillä saatuja kladogrammeja toisiinsa.
Tulokset
Tulostamamme kolme konsensusfylogeniapuuta. Kuvissa on alleviivattu punaisella aivan väärään paikkaan eksyneet lajit, kuten N. cinerea alimmassa, Neighbor joining -puussa, jossa se on joutunut suorastaan ulkoryhmäksi. Sinisellä pallolla on merkitty lajit, joilla on havaittu akiasmaattinen meioosi.
(Kuvia voi tarkastella lähemmin klikkaamalla ne suuremmiksi.)
Tulosteissa lajit ovat koodinimillä seuraavanlaisesti:
Microscho Micronectus scholtzi N
Gerrarg Gerris argentatum G
Saldusal Saldula saltatoria L
Lioctrip* Liocoris tripustulatus C
Orinig* Orius niger C
Myrmex* Myrmedobia exilis C
Anthonem* Anthocoris nemorum C
HimApte* Himacerus apterus C
Nablim* Nabis limbatus C
Nysthy Nysius thymi P
Himboo Himacerus boops C
Myrmir Myrmus miriformis P
Alca Alydus calcaratus P
Nepacin Nepa cinerea N
Hemiwil Hemiowoodwardia wilsoni (Homoptera)
Cryptul Cryptococcus ulmi (Homoptera)
- = akiasmaattinen meioosi; N=Nepomorpha; L=Leptodomorpha; C=Cimicomorpha; P=Pentatomorpha
Tarkastelu
Tulostemme perusteella akiasmaattinen meioosi näyttäisi olevan monofyleettinen ominaisuus erilaissiipisten lahkossa, mutta saamamme tulokset eivät vaikuta kovin luotettavilta. Useissa kohdissa consensus-puiden haarakohtien todennäköisyydet ovat reilustikin alle 50 %. Toisaalta jokaisessa saadussa puussa ala-lahkon Cimicomorpha jäsenet ovat asettuneet omaksi haarakseen, ja vain tämän alalahkon lajeilla on todettu akiasmaattinen meioosi Heteroptera-lahkon sisällä.
Tuloksissa on myös outoa vaihtelua ulkoryhmäläisten H. wilsoni ja C. ulmi sekä muiden kuin Cimicomorpha-alalahkon jäsenten, lukuunottamatta Himacerus boopsia, asettumisessa puiden haaroihin. Tämä todennäköisesti johtuu tietojenkäsittelyvirheestä sekvenssien valmisteluvaiheessa BioEdit-ohjelmassa.
Alalohkojen asettautuminen tuloksissamme ei ole järin samanlaista kuin kirjallisuuden vastaavassa; Cimicomorphan lisäksi myös Pentatomorpha on asettunut puissa omaksi haarakseen. Joukkoon eksynyt H. boops oli melko puutteellisesti editoitu ja peräisin edellisten vuosien kurssilaisilta. Nepomorphalta ja Gerromorphalta ei ollut kuin muutama laji yhteensä, ja niistäkin N. cinerea käyttäytyi hyvin vaihtelevasti eri puissa, mitä todennäköisimmin johtuen jostain omasta virheestämme tietojenkäsittelyssä. Nepomorpha-lahkon M. scholtzi ja Gerromorpha-lahkon G. argentatum esiintyivät silti lähekkäin suhteessa Pentatomorphaan ja Cimicomorphaan jokaisessa puussa, kuten luentodioissa esitetty morfologisin keinoin rakennettu sukupuu ennustaa (Štys et Kerzhner, 1975). Kyseisten tutkijoiden mukaan myös Nepomorpha- ja Pentatomorpha-alalahkoissa esiintyy koiraiden akiasmaattista meioosia, mutta tässä tutkimuksessa emme löytäneet sen kuin yhdestä haarasta, ja se oli Cimicomorpha.
